一种鉴别猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒的HRM检测引物及方法技术

本发明专利技术属于生物检测技术领域，公开了一种鉴别猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒的HRM检测引物及方法，该引物序列如SEQ ID NO：1~2所示，其特异性好，该引物对FMDV和SVV进行PCR扩增，然后通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况，采集荧光数据，根据两者的熔解曲线不同来鉴别FMDV和SVV；利用所述引物进行PCR扩增后即可鉴别两种基因型，全部操作过程只需3小时，不需要病毒的细胞培养，极大缩短了分型所需时间；费用低，不需要特异性探针，荧光饱和染料廉价易得；准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物检测
，更具体地，涉及一种鉴别猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒的HRM检测引物及方法。
技术介绍
口蹄疫是由口蹄疫病毒（FootandMouthDiseaseVirus，FMDV）引起的急性、热性、高度接触性传染的动物疫病，侵染对象包括猪、牛、羊等主要畜种及其他偶蹄动物。发病猪的特征症状是发热，口鼻、蹄部和母猪乳头发生水泡，突然发生急性跛行，死亡剖检时可见虎斑心和出血性胃肠炎病变。口蹄疫传染性强，发病率高，国际动物卫生组织（OIE）将该病列为A类传染病之首；塞内加谷病毒（SenecaValleyvirusSVV）是单股正链RNA病毒，是小核糖核酸病毒科Senecavirus病毒属的典型代表。其最初被认为是PER.C6细胞培养物中的污染物，随后在美国和加拿大的猪群中被分离，2007年在美国一屠宰场的猪群中出现水疱性疾病临床症状，约80%的猪出现跛足，PCR检测猪口蹄疫、猪水疱病、水疱性口炎和水疱性疹均为阴性，而SVV却为阳性，从而被认为是原发性水疱性疾病。近期猪塞内加谷病毒（SVV）在巴西猪群中的感染与爆发，证明了猪塞内加谷病毒很有可能是猪的原发性水疱性疾病病原之一。2015年我国及巴西出现了几次SVV感染猪群并出现严重的临床发病及死亡症状，造成严重的经济损失。由于该病与口蹄疫的临床症状及解剖症状极为相似，在临床和组织病理学上很难区分，其鉴别诊断通常需借助实验室诊断技术，传统的检测方法费时费力，操作方法繁琐，不利于疾病的及时诊断治疗，造成重大的经济损失。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种鉴别猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒的HRM检测引物。本专利技术的第二个目的是提供一种含有上述检测引物的检测试剂盒。本专利技术的第三个目的是提供上述检测引物或检测试剂盒的应用。本专利技术的第四个目的是提供一种鉴别猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒的HRM检测方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案予以实现的：一种鉴别猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒的HRM检测引物，该引物为P1和P2，序列如SEQIDNO：1~2所示。P1：ACTTTTCTGAAAGATGAAAT（SEQIDNO：1）。P2：TTGTCDGCTGGAGTCAT（SEQIDNO：2）。本专利技术通过分析FMDV和SVV基因组，设计得到一对既能扩增FMDV又能扩增SVV的引物，利用该引物对FMDV和SVV进行PCR扩增，然后通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况，采集荧光数据，根据两者的熔解曲线不同来鉴别FMDV和SVV。本专利技术还提供一种鉴别猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒的HRM检测试剂盒，含有引物P1和P2；优选地，所述引物的浓度为0.5μM。优选地，所述试剂盒还含有PCR反应缓冲液、荧光染料；更优选地，所述荧光染料为LCGreen染料。本专利技术还提供一种鉴别猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒的HRM检测方法，从待测样品中提取病毒基因组DNA作为模板DNA，利用权利要求1所述引物对对模板DNA进行PCR扩增，对扩增产物进行HRM分析，根据HRM曲线鉴别猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒。当所述基因组DNA为RNA时，其PCR扩增的反应体系为：模板DNA1μL，2×1-StepBuffer12.5μL，PrimeScript1-stepEnzymeMix0.5μL，P11μL，P21μL，LCGreen染料1μL，用双蒸水补足20μL；PCR的反应程序为：（i）50℃30min；（ii）94℃预变性15min；（iii）94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，步骤（iii）循环35次；（iiii）72℃终延伸10min；80℃到93℃以0.3℃/s的熔解速率进行HRM分析。当所述基因组DNA为cDNA时，其PCR扩增的反应体系为：模板DNA2μL，PremixEx-Taq10μL，P11μL，P21μL，LCGreen染料1μL，用双蒸水补足20μL；PCR的反应程序为：（i）94℃预变性5min；（ii）94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，步骤（ii）循环35次；（iii）72℃终延伸10min；80℃到93℃以0.3℃/s的熔解速率进行HRM分析。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供了一种鉴别猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒的HRM检测引物，该引物特异性好，该引物对FMDV和SVV进行PCR扩增，然后通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况，采集荧光数据，根据两者的熔解曲线不同来鉴别FMDV和SVV；利用所述引物进行PCR扩增后即可鉴别两种基因型，全部操作过程只需3小时，不需要病毒的细胞培养，极大缩短了分型所需时间；费用低，不需要特异性探针，荧光饱和染料廉价易得；准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。附图说明图1为猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒标准样品HRM标准化熔解曲线。图2为猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒标准样品HRM峰型化熔解曲线。图3为猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒临床样品HRM标准化熔解曲线。图4为猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒临床样品HRM峰型化熔解曲线。图5为猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒PCR-HRM引物特异性凝胶电泳图。图6为对比例1所述猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒峰型化熔解曲线。图7为对比例2所述猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒峰型化熔解曲线。具体实施方式下面将结合说明书附图和具体实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制。不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤、条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。若无特别说明，实施例中所用的实验方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法和技术，试剂或材料均为通过商业途径得到。实施例1PCR引物设计根据猪口蹄疫病毒和猪塞内加谷病毒基因序列设计出扩增猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒部分基因序列的引物对P1和P2，其碱基序列如下所示。P1：ACTTTTCTGAAAGATGAAAT（SEQIDNO：1）；P2：TTGTCDGCTGGAGTCAT（SEQIDNO：2）。实施例2标准样品的制备及其PCR-HRM分析（1）病毒RNA的提取：用天根的核酸自动抽取仪分别提取病料样品中的猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒RNA。病料样品可以是水泡液、水泡皮等易于获得且对动物体无严重伤害的样品；也可以是心脏、气管等组织样品。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴别猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒的HRM检测引物，其特征在于，该引物为P1和P2，序列如SEQ ID NO：1~2所示。

【技术特征摘要】
1.一种鉴别猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒的HRM检测引物，其特征在于，该引物为P1
和P2，序列如SEQIDNO：1~2所示。
2.一种鉴别猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒的HRM检测试剂盒，其特征在于，含有权利
要求1所述引物。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述引物的浓度为0.5μM。
4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有PCR反应缓冲液、
荧光染料。
5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述荧光染料为LCGreen染料。
6.一种鉴别猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒的HRM检测方法，其特征在于，从待测样品
中提取病毒基因组DNA作为模板DNA，利用权利要求1所述引物对模板DNA进行PCR扩增，对扩
增产物进行HRM分析，根据HRM曲线鉴别猪口蹄疫病毒与猪塞内加谷病毒。
7.根据权利要求6所述的HRM检测方法，其特征在于，当所述基因组DNA为RNA时，其PCR
扩增的反应体系为：模板DNA1μL，2×1-StepBuffer12.5μL，PrimeScript1-step<...

【专利技术属性】
技术研发人员：马静云，郭鹏举，朱余军，伍绮文，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44