大肠癌唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法技术

本发明专利技术公开了一种大肠癌唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，包括以下步骤：样品收集；纳米磁珠预处理；样品预处理；唾液样品洗脱上样；质谱分析；数据采集；数据分析；建立诊断模型。本发明专利技术将WCX与MALDI-TOF-MS技术相结合，进一步探索肠癌患者唾液差异表达蛋白，发现了312个肠癌差异蛋白质峰，其中有37个差异蛋白质峰有统计学意义。选取m/z为2501.26、4779.95、3140.39建立肠癌组与正常对照组的判别模型，该模型的灵敏度和特异度均高，采用十字交叉验证，灵敏度和特异度分别为85％、88％，可见该模型对肠癌的诊断具有一定的价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于蛋白质谱应用
，具体地说，涉及一种大肠癌唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法。
技术介绍
结直肠癌(CRC)是世界范围内男性和女性第三个常见的癌症，是胃肠道常见的恶性肿瘤，以41-65岁发病率最高。肠癌如果早期发现5年生存率可达90％，而有转移的进展期大肠癌其5年生存率低于10％。内窥镜检查仍然是大肠癌诊断的金标准，虽然内镜设备得到了一次次升级变革，从传统的全结肠电子内镜到放大内镜及染色内镜、窄带内镜(NBI)、自发荧光内镜(AFE)、共聚焦激光显微内镜(CEM)、超声内镜(EUS)、结肠胶囊内镜(CCE)等各项先进技术在内镜中的应用，提高了分辨率，但仍然价格昂贵而又对人体伤害较大，这严重限制了大肠癌的早期诊断。而新近发展起来的大肠癌肿瘤标志物检测，单项指标检测准确率低，多项指标联合检验虽可一定程度上提高检测的准确性，但结果的准确性(＜70％)仍不能满足临床诊断肠癌需要，且血液检测亦为有创检测。目前为止还没有一个快速、准确而又适合于大规模筛查的大肠癌早期诊断方法，因此，寻求一个简便、快速、准确率高的无创伤检查新方法势在必行。随着质谱仪的发展和蛋白质组学研究的而深入，产生了蛋白质指纹图谱的诊断新技术，该技术是通过质谱分析不同疾病血清中有许多潜在的生物标志物，通过质谱定量和定性分析这些生物标志物可用于疾病的诊断。该方法已经成功的用于研究SARS、癌症等诊断标志物。目前蛋白指纹图谱技术在肠癌的研究主要有：大肠癌(CRC)与正常人的鉴别诊断、大肠癌无转移(CRC)与大肠癌肝转移(同时性肝转移(SLM)/异时性肝转移(MLM))的鉴别、大肠良性病变与大肠癌鉴别，以及大肠癌预后模型等。采用蛋白质组学技术进行大肠癌研究，各研究者均得到敏感性、特异性、准确性较高的分子诊断模型，然而，各研究者所筛选得到的差异蛋白质峰差异很大。CRC与正常对照组的差异蛋白对比研究，柳俊刚等发现M/Z为3223.43、7971.57、11493.00；崔丹瑜等发现M/Z为5909、5341、2685、2811、3928、6635、8933；林建军等发现M/Z为2870.7、3084.0、9180.5、13748.8；张巍等发现为2974、3282、5948、2957、2982、5920、6647、6661；LiaoCC等发现1800-16000Da范围内的73个峰；XuW发现15个差异蛋白(2900-9000Da)；周智勇等发现26个下调蛋白、52个上调蛋白，范围在4000Da-1110Da。CRC无转移与CRC肝转移的差异蛋白对比研究，柳俊刚等发现M/Z为3223.43、3511.88、8894.49；崔丹瑜等发现在肝转移组M/Z为7570、7795、7939、8137、8925、9196、11814、7837低表达，而M/Z为5813蛋白点高表达。肠良性病变与CRC差异蛋白对比研究，XuW等发现M/Z为3570、3101、4869在腺瘤组高表达，在CRC组低表达；张巍等发现M/Z为3016、66172个蛋白点在两组比较中差异显著。李小琼等对正常组、良性病变组以及CRC(术前)组三者的差异蛋白研究发现7个差异点，M/Z分别为4955、5325、5890、6615、7739、8109、8575.于新哲等发现，结直肠癌无转移(CRC)对比结直肠癌异时性肝转移组(MLM)，得到0个差异蛋白峰，无统计学差异(P>0.05)；MLM对比SLM，得到1个差异蛋白峰，M/Z＝4355.26(P＜0.05)；由此可见，实验可重复性不足，可能与实验中样品的预处理方法(芯片的种类、厂家、批号等)、试验操作者技能水平、研究者所采取的质谱方法(MALDI、SELDI或其他)、数据分析方法(SVM、留一法等)等不一致有关。现有研究多针对肠癌患者血液标本或者组织标本的有创检测，受试者依从性差，不利于反复采样、实时动态监测以及人群盲筛推广，具有一定的限制性，不能广泛应用。因此，提供一种诊断模型简便、快速、标本用量少，灵敏度高，特异性好的大肠癌唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型的建立方法，就成为该
急需解决的技术难题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决现有肠癌检测技术对受试者依从性差，检查方法复杂，灵敏度低的问题，提供了一种大肠癌唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种大肠癌唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，包括以下步骤：(1)样品收集；(2)纳米磁珠预处理；(3)样品预处理：取出冷冻保存的唾液样品，冰上解冻，所有唾液样品均1次冻融，取5μl唾液加入10μl的U9裂解液，混合孵育30min后，加入185μl的WashBuffer稀释(唾液最终上样量为2.5μl)；(4)唾液样品洗脱上样：③向每个装有纳米磁珠的PCR管中分别加入100μl预处理后的唾液样品，混匀，置于室温孵育30min，将PCR管置于磁铁上孵育1min，去除上清液；④每管加入100μl的WashBuffer洗脱5min，然后将PCR管置于磁铁上孵育1min，去除上清液；再重复步骤④操作一次，以洗脱更干净，获得较纯的目的蛋白；⑤在PCR管中加入10μl的ElutionBuffer洗脱5min，将PCR管置于磁铁上孵育1min，取5μl上清液移至另一个PCR管中；⑥将装有5μl上清液的PCR管中加入5μl的CHCA饱和溶液，充分混匀，至样品颜色发灰，而没有明显的沉淀时，取2μl混合溶液，加样到Au/Steel芯片上，晾干后放入仪器读取；(5)质谱分析：采用质谱仪读所述Au/Steel取芯片信息，设置激光强度为190，灵敏度为5；(6)数据采集；(7)数据分析；(8)建立诊断模型：用BiomarkerPatternSoftware5.0.2采用决策树算法计算出多个变量变化对两样本的判别价值，确定最佳的诊断模型。进一步的，所述步骤(1)样品收集方法为：肠癌组和正常对照组在取材前一天晚上临睡前清水漱口，之后不再进食任何食物和药物，于第二天晨起后漱口前采用非刺激性唾液采集方式空腹取材，前5min内的唾液自然吞下后开始收集，收集到的唾液置于冰浴中的15ml唾液离心管内，4℃静置1h后，3000r/min、4℃离心10min，冰浴上分装在1ml的EP管中，每管200μl，于-80℃冰箱冷冻保存备用。进一步的，所述步骤(2)纳米磁珠预处理方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大肠癌唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)样品收集；(2)纳米磁珠预处理；(3)样品预处理：取出冷冻保存的唾液样品，冰上解冻，所有唾液样品均1次冻融，取5μl所述唾液样品加入10μl的U9裂解液，混合孵育30min后，加入185μl的Wash Buffer稀释；(4)唾液样品洗脱上样：③向每个装有纳米磁珠的PCR管中分别加入100μl预处理后的所述唾液样品，混匀，置于室温孵育30min，将所述PCR管置于磁铁上孵育1min，去除上清液；④每管加入100μl的Wash Buffer洗脱5min，然后将所述PCR管置于磁铁上孵育1min，去除上清液；再重复步骤④操作一次；⑤在所述PCR管中加入10μl的Elution Buffer洗脱5min，将所述PCR管置于磁铁上孵育1min，取5μl上清液移至另一个PCR管中；⑥将装有5μl上清液的PCR管中加入5μl的CHCA饱和溶液，充分混匀，至样品颜色发灰，而没有明显的沉淀时，取2μl混合溶液，加样到Au/Steel芯片上，晾干后放入仪器读取；(5)质谱分析：采用质谱仪读取所述Au/Steel芯片信息，设置激光强度为190，灵敏度为5；(6)数据采集；(7)数据分析；(8)建立诊断模型：用Biomarker Pattern Software 5.0.2采用决策树算法计算出多个变量变化对两样本的判别价值，确定最佳的诊断模型。...

【技术特征摘要】
1.一种大肠癌唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法，其特征在于，
包括以下步骤：
(1)样品收集；
(2)纳米磁珠预处理；
(3)样品预处理：取出冷冻保存的唾液样品，冰上解冻，所有唾液样
品均1次冻融，取5μl所述唾液样品加入10μl的U9裂解液，混合孵育30min
后，加入185μl的WashBuffer稀释；
(4)唾液样品洗脱上样：③向每个装有纳米磁珠的PCR管中分别加入
100μl预处理后的所述唾液样品，混匀，置于室温孵育30min，将所述PCR
管置于磁铁上孵育1min，去除上清液；④每管加入100μl的WashBuffer洗
脱5min，然后将所述PCR管置于磁铁上孵育1min，去除上清液；再重复步
骤④操作一次；⑤在所述PCR管中加入10μl的ElutionBuffer洗脱5min，将
所述PCR管置于磁铁上孵育1min，取5μl上清液移至另一个PCR管中；⑥
将装有5μl上清液的PCR管中加入5μl的CHCA饱和溶液，充分混匀，至样
品颜色发灰，而没有明显的沉淀时，取2μl混合溶液，加样到Au/Steel芯片
上，晾干后放入仪器读取；
(5)质谱分析：采用质谱仪读取所述Au/Steel芯片信息，设置激光强
度为190，灵敏度为5；
(6)数据采集；
(7)数据分析；
(8)建立诊断模型：用BiomarkerPatternSoftware5.0.2采用决策树算法
计算出多个变量变化对两样本的判别价值，确定最佳的诊断模型。
2.如权利要求1所述的大肠癌唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方
法，其特征在于，所述步骤(1)样品收集方法为：肠癌组和正常对照组在
取材前一天晚上临睡前清水漱口，之后不再进食任何食物和药物，于第二天
晨起后漱口前采用非刺激性唾液采集方式空腹取材，前5min内的唾液自然
吞下后开始收集，收集到的唾液置于冰浴中的15ml唾液离心管内，4℃静置
1h后，3000r/min、4℃离心10min，冰浴上分装在1ml的EP管...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴正治，曹美群，孙珂焕，黄飞娟，谢梦洲，贺佐梅，
申请(专利权)人：深圳市老年医学研究所，吴正治，
类型：发明
国别省市：广东;44