本发明专利技术属于微生物发酵领域，涉及生产2‑酮基‑L‑古龙酸的菌株及其生产方法，具体涉及利用微生物发酵的手段将底物L‑山梨糖转化为2‑酮基‑L‑古龙酸的菌株及工艺。本发明专利技术菌株从土壤中分离，可与通常工业发酵伴生菌株巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)搭配，并产生2‑KGA的新菌株SPU B805。SPUB 805已送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏。SPU B805与菌株Bacillus megaterium搭配，在不改变现有培养工艺的条件下，可在26‑34℃生长及产2‑KGA，在底物L‑山梨糖为8％的浓度下，经过32‑44h摇瓶发酵，2‑KGA的转化率为90％以上，在底物L‑山梨糖为10％的浓度下，5L发酵罐36‑48h发酵，2‑KGA的转化率可达到95％以上。
【技术实现步骤摘要】
:本专利技术属于微生物发酵领域，涉及一株生产2-酮基-L-古龙酸(2-Keto-L-Gulonicacid，2-KGA)的菌株及其生产方法，具体涉及利用微生物发酵的手段将底物L-山梨糖转化为2-KGA的菌株及工艺。
技术介绍
：VC是人体必需的一种维生素，在抗氧化和维持新陈代谢平衡等方面具有广泛的生理作用，在医药工业、食品工业、饲料行业以及化妆品行业上均有重要用途。其应用范围广阔，市场规模巨大。目前，全球90％以上的VC生产，均利用我国专利技术的“二步发酵法”。其第一步发酵是在氧化葡萄糖酸杆菌作用下将D-山梨醇氧化为L-山梨糖。第二步是在一种混合菌系的作用下将L-山梨糖进一步氧化成VC的重要中间体2-酮基-L-古龙酸(2-KGA)。最后经过化学转化使2-KGA生成VC。第二步发酵生产2-KGA是决定VC发酵产率和成本的关键步骤。在其混合菌系中：酮古龙酸菌是产2-KGA的关键菌株，具有氧化底物L-山梨糖为2-KGA的酶系统。但该菌独立生长及产2-KGA能力非常弱，需要巨大芽孢杆菌提供某些“效应物”促进其生长及产2-KGA。该菌本身能独立生长，却不能转化L-山梨糖为2-KGA。由于L-山梨糖在转化为2-KGA的过程中，其中间产物L-山梨酮可在山梨酮脱氢酶(SNDH)的作用下，伴随副产物维生素C的产生；同时L-山梨糖亦作为酮古龙酸菌自身碳源参与糖代谢作用，故在实际发酵过程中，2-KGA的转化率通常在90％左右，难以进一步提升。在本专利技术中，由于SPUB805具有良好的生长状态，并且缺乏酮古龙酸菌体内的一条重要糖代谢途径(EDpathway)，同时亦缺乏伴随副产物VC产生的SNDH，故在产2-KGA发酵的过程中，该菌具有较高的产物转化率及较短的发酵周期。现有技术中，未见具有上述性状特征的天然酮古龙酸菌及基因工程菌株的报道。
技术实现思路
：本专利技术要解决的一个技术问题是提供一株可高产2-KGA的微生物菌株普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonicigeniumvulgare)(SPUB805)，减少VC二步发酵过程中，底物L-山梨糖参与糖代谢及产生其它副产物的数量，进而提高目标产物2-KGA的转化率。本专利技术的技术方案如下：经过实验室分离、筛选及进一步人工驯化得到了一株性状稳定，并具有较高2-KGA转化率的菌株SPUB805，连续40次传代证明该菌性状稳定。本专利技术所述的普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonicigeniumvulgare)(SPUB805)为革兰氏阴性菌，短杆，可形成短链或丝状体，不能形成芽孢(见图1)；在原有酮古龙酸菌固体培养基培养4天的菌落形态为点状，凸起，完整，光滑的圆形菌落，菌落表面成油状，透明，有棕色色素产生。基于16SrDNA测序及生理生化指标考察，经鉴定该菌为普通生酮基古龙糖酸菌(Ketogulonicigeniumvulgare)(见图2)。进一步利用454-焦磷酸测序技术，构建并完成了该菌株的全基因组完成图。并进一步完成了该菌株的基因组注释及与已知酮古龙酸菌(Y25及WSH-001)基因组的比较基因组学研究。比较基因组分析表明，SPUB805与已知菌株Y25及WSH-001最大的区别为缺少两菌体内分别存在的大质粒pYP2及pKVU_200，同时SPUB805基因组与其它两株菌相比亦存在部分基因片段的重排(见图3)，除此各功能基因几乎相同。由于SPUB805质粒的缺失，导致了该菌体内缺乏酮古龙酸菌ED途径三种关键酶(包括：2-dehydro-3-deoxygluconokinase，EC:2.7.1.45；phosphogluconatedehydratase，EC:4.2.1.12及2-dehydro-3-deoxyphosphogluconatealdolase，EC:4.1.2.14)及一种利用L-山梨酮直接产生维生素C的关键酶L-sorbosonedehydrogenase，EC:1.1.5.2，见表1。表1.与已知KetogulonicigeniumvulgareY25及WSH-001比较，SPUB805体内缺乏的关键酶及其对应的酶促反应本专利技术要解决的另一个技术问题是提供菌株酮古龙酸菌SPUB805发酵生产2-KGA的方法，发酵方法如下：1.分离及斜面培养基：酵母膏0.1-10g/L、牛肉膏0.1-10g/L、玉米浆0.1-30g/L、蛋白胨0.1-15g/L、无水硫酸镁0.1-10g/L、山梨糖0.2-20g/L、碳酸钙0.1-10g/L、琼脂20g/L、pH5.0-8.0。2.种子培养基：L-山梨糖0.5-40g/L、玉米浆0.1-30g/L、蛋白胨0.1-15g/L、酵母膏0.1-5g/L、葡萄糖0.1-50g/L、D-山梨醇0.2-20g/L、D-甘露醇0.1-20g/L、碳酸钙0.1-10g/L、pH5.0-8.0。3.发酵培养基：L-山梨糖10-150g/L、玉米浆0.1-20g/L、尿素1-40g/L、无水硫酸镁0.1-0.5g/L、pH5.0-8.0；4.培养方法：(1)斜面培养挑取SPUB805菌体与伴生菌Bacillusmegaterium于斜面培养基搭配26-34℃混合培养3-5天。(2)种子培养将SPUB805与伴生菌Bacillusmegaterium混合培养的斜面接入15～30mL的种子培养基的250mL三角瓶中16-32h，于26～34℃震荡培养，转速为150-300rpm，制备发酵用种子液。(3)摇瓶发酵培养将培养好的种子液按接种量5-25％(v/v)接种于装有20～40mL发酵培养基的250mL三角瓶中，于26～34℃震荡培养，转速为150-300rpm，培养32-44h。(4)发酵罐培养发酵培养基培养10-12h后采用连续流加L-山梨糖工艺，控制底物L-山梨糖浓度，L-山梨糖底物初始度为1-5％，终点累积流加量控制在8-12％，优选8-10％，流加时间控制在12-36h，使用20-25％的碳酸钠控制pH为6.5-8.0。(5)本专利技术提供了该菌株在发酵过程中，产生2-KGA的最佳温度为30-32℃，摇瓶发酵L-山梨糖最佳终点浓度为8％；发酵罐培养最佳底物L-山梨糖浓度为4％，最佳L-山梨糖流加总量为6-10％。本专利技术的有益效果：与原VC二步发酵生产菌株相比较，在底物L-山梨糖为8％的浓度下，经过32-44h摇瓶发酵，2-KGA的转化率为90％以上(对照组为85％)，在底物L-山梨糖为8-10％的浓度下，5L发酵罐36-48h发酵，2-KGA的转化率可达到95％以上(对照组约为90％)。本专利技术使用的普通生酮基古龙糖酸菌(Ketogulonicigeniumvulgare)(SPUB805)已送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏。保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。保藏日期2016年8月17日，保藏编号为CGMCCNo.12858。附图说明：图1为与Bacillusmegaterium混合培养的KetogulonicigeniumvulgareSPUB805光镜1000倍下的形态。图2为KetogulonicigeniumvulgareS本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种普通产酮古洛糖酸菌(Ketogulonicigenium vulgare)，其特征在于，所述的普通产酮古洛糖酸菌缺乏SEQ ID：1、SEQ ID：2、SEQ ID：3和SEQ ID：4中的一种或几种。
【技术特征摘要】
1.一种普通产酮古洛糖酸菌(Ketogulonicigeniumvulgare)，其特征在于，所述的普通产酮古洛糖酸菌缺乏SEQID：1、SEQID：2、SEQID：3和SEQID：4中的一种或几种。2.如权利要求1所述的普通产酮古洛糖酸菌，其特征在于，所述的普通产酮古洛糖酸菌体内亦缺乏将代谢中间产物L-山梨酮直接转化为维生素C的关键酶，L-sorbosonedehydrogenase。3.如权利要求1或2所述的普通产酮古洛糖酸菌，其特征在于，所述的普通产酮古洛糖酸菌体内缺乏这类菌体内存在的大质粒，如菌株K.vulgareY25体内存在的质粒pYP2或菌株K.vulgareWSH-001中体内的质粒pKVU_200。4.权利要求1，2或3所述的普通产酮古洛糖酸菌，其特征在于，该菌种的保藏编号为CGMCCNo.12858。5.权利要求1-4中任何一项所述的普通产酮古洛糖酸菌在生产2-酮基-L-古龙酸中的应用。6.权利要求1-4中任何一项所述的普通产酮古洛糖酸菌在制备维生素C中的应用。7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，普通产酮古洛糖酸菌通过如下方法制备2-酮基-L-古龙酸：(1)斜面培养挑取普通产酮古洛糖酸菌菌体与伴生菌Bacillusmegaterium于斜面培养基搭配26-34℃混合培养3-5天；(2)种子培养将普通产酮古洛糖酸菌与伴生菌Bacillusmegaterium混合培养的斜面接入15～30mL的种子培养基的250mL三角瓶中16-32h，于26～34℃震荡培养，转速为150-300rpm，制备发酵用种子液；(3)摇瓶发酵培养将...
【专利技术属性】
技术研发人员：张怡轩，李野，
申请(专利权)人：沈阳药科大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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