一种温郁金来源的倍半萜合酶、基因、载体、工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种温郁金来源的倍半萜合酶、基因、载体、工程菌及其应用，所述酶氨基酸序列为SEQ.ID NO.2所示。本发明专利技术中的催化剂源自高产β‑榄香烯的药用植物温郁金，体外活性证实，其可以催化底物FPP生成β‑榄香烯，最终榄香烯的产量达到0.345μg，转化率为34.5％。

【技术实现步骤摘要】
(一)
本专利技术涉及一种β-榄香烯的制备，特别涉及一种温郁金来源的倍半萜合酶、基因、载体、工程菌及其制备β-榄香烯的应用。(二)
技术介绍
榄香烯(Elemene)是从姜科植物温郁金中提取出来的具有抗癌作用的有效成分，是我国自主研发的一类新型倍半萜药物。该药在临床运用时，高效、副作用少；能够改善微循环，有助于化疗、放疗药物进入癌组织发挥作用；具有选择性抑制肿瘤细胞增殖和提高免疫功能的双重效应；还可直接作用于细胞膜，使肿瘤细胞破裂死亡。目前榄香烯正被广泛应用于肺癌、胃癌、大肠癌等恶性肿瘤的治疗。虽然榄香烯系列抗肿瘤植物药的开发和临床应用正如火如荼，市场份额也在不断扩大，但是从天然植物温郁金中提取分离榄香烯仍存在许多技术难点：第一，温郁金植株仅块根中含有榄香烯，且含量极低，约占千分之一到千分之二；同时榄香烯的含量易受品种，根茎质量，种植环境等诸多因素影响。第二，挥发油中成分复杂，榄香烯与许多结构相似的倍半萜类化合物混杂在一起，必须通过精密分馏、分子蒸馏或超临界二氧化碳法进行初分，再通过薄层色谱和柱层析，经过多次分离才能得到纯品，因此榄香烯的提取工艺要求高难度大。另外，化学合成榄香烯的工艺十分复杂，反应步骤近10步，其中两步反应需在-78℃低温条件进行，且需要用到二氯甲烷、氰化钠、甲苯等剧毒化合物，不利于环境保护；最终合成的产物为外消旋混合物，需要进行拆分才能获得目标产物，产率只有50％，因此化学合成路线经济性差，无法进行商业化生产。这使得榄香烯原料药的生产成本较高，对其市场推广和全球化营销起到一定的阻碍作用。采用酶催化方法进行β-榄香烯的生物合成具有一定的优势，例如反应条件温和、选择性高、产物专一性高。而进行酶催化的首要前体是优质的生物催化剂的获得。倍半萜合酶能够催化法尼基焦磷酸(FPP)生成功能结构及活性多样的倍半萜化合物，同时在催化过程中，其机制的多样性将对所生成的倍半萜结构的丰富性具有重要的影响。目前，已有多种萜类合酶如黄花蒿来源的β-法呢烯合酶等都陆续地被科学家们发现，这也预示着越来越多的新型化合物被发掘。研究萜类合酶基因的克隆、表达，有助于发掘萜类化合物的合成机制，从而能够进一步的研究代谢调控以及蛋白工程的改造。因此，对温郁金来源的倍半萜合酶研究具有重要的意义。(三)
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种温郁金来源的倍半萜合酶、基因及其在催化FPP生成榄香烯中的应用。该倍半萜合酶属于萜类合成酶，最适反应温度为35℃，最适反应pH为8.5，具有很好的催化底物FPP生成β-榄香烯的活性。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种温郁金来源的倍半萜合酶(即CwSQS)，所述酶氨基酸序列为SEQ.IDNO.2所示。经实验证明，上述结构的蛋白质属于萜类合成酶，能催化FPP生成一定量的榄香烯。不难想到的是，在不改变蛋白质特性的情况，适当改变氨基酸序列，仍具有本专利技术醇脱氢酶特性。比如，氨基酸序列SEQIDNO.2的保守性变异多肽，或其活性片段、或其衍生物。本专利技术提供一种温郁金来源的倍半萜合酶编码基因(即CwSQS基因)，所述编码基因核苷酸序列为SEQIDNo.1所示。本专利技术提供一种含有所述温郁金倍半萜合酶编码基因的重组载体。进一步，所述重组载体按如下方法制备：将倍半萜合酶编码基因与pET28a载体连接，获得连接产物CwSQS-pET28a，即为含有温郁金倍半萜合酶编码基因的重组载体。将重组载体转化E.coliDH5α感受态细胞中，在含有50mg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃、180rpm下摇床培养1h，离心取沉淀后涂布于含有50mg/mL卡那霉素的LB平板，过夜培养后挑取单克隆进行PCR和提取重组质粒，即获得含有温郁金倍半萜合酶编码基因的重组质粒。本专利技术还提供一种含有所述温郁金倍半萜合酶编码基因或重组载体的重组基因工程菌。本专利技术提供一种所述温郁金倍半萜合酶编码基因在制备重组倍半萜合酶中的应用。具体所述的应用为：将含有所述温郁金倍半萜合酶编码基因的重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌在含50mg/mL卡那霉素的LB培养基上37℃培养12h至OD600＝0.6，加入IPTG浓度为0.2mM，25℃诱导表达15h，将诱导培养液分离纯化，获得含有重组倍半萜合酶基因的菌体细胞，采用镍柱进行亲和层析分离获得倍半萜合酶。本专利技术提供一种所述温郁金来源的倍半萜合酶在制备β-榄香烯中的应用，所述的应用为：以含温郁金来源的倍半萜合酶编码基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体超声破碎后的上清液经纯化的纯酶为催化剂，以法尼基焦磷酸(FPP)为底物，在二硫苏糖醇、MgCl2和稀甘油(即1,2,3-丙三醇)的作用下，于pH为6.0-10.0的缓冲液中构成反应体系，在5-50℃(优选20-40℃，更优选35℃)进行生物转化反应，反应液分离纯化，获得β-榄香烯。所述反应体系中，催化剂的用量为0.1-1μg/mL，优选0.642μg/mL，所述底物终浓度为1-5μg/mL，优选2μg/mL，所述二硫苏糖醇和MgCl2的终浓度分别为0.1-2mM，优选1mM和2-20mM，优选10mM，1,2,3-丙三醇体积终浓度为5-20％，优选10％。进一步，所述催化剂按如下方法制备：将含温郁金来源的倍半萜合酶编码基因工程菌(优选E.CoilBL21codonplus/pET28a/CwSQS)接种在含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇床过夜培养；再将培养液以体积浓度1％的接种量接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃培养，直到菌液OD600达到0.6-0.8时加入终浓度0.5mM的IPTG，28℃诱导16h后，离心收集湿菌体；将湿菌体用pH7.4磷酸缓冲液重悬，超声破碎细胞，离心取上清，用0.22μm醋酸纤维素滤膜过滤，滤液用镍柱亲和层析，收集目标组分，获得纯酶。与现有技术相比，本专利技术的有益效果主要体现在：本专利技术中的催化剂源自高产β-榄香烯的药用植物温郁金，体外活性证实，其可以催化底物FPP生成β-榄香烯，最终榄香烯的产量达到0.345μg，转化率为34.5％。(四)附图说明图1SDS-PAGE分析重组CwSQS工程菌经IPTG诱导表达结果(M：marker；1，诱导前；2，诱导后；3，诱导后沉淀部分；4，诱导后上清部分；5，6：CwSQS纯化后)。图2β-榄香烯标准品(a)与CwSQS催化反应产物(b)的GC-MS分析图。图3反应温度对产物浓度影响虚线图。图4pH值对产物浓度影响虚线图。图5反应时间对产物浓度影响虚线图。图6GC分析CwSQS重组蛋白催化产物，β-榄香烯出峰时间为15.902min。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：实施例11、CwSQS基因全长的克隆采用高通量测序技术，提取温郁金块根、嫩叶、芽和茎混合组织的RNA，反转录后送上海捷瑞生物技术有限公司进行测序，采用生物信息学BLAST分析方法，与Genbank数据库进行比对，获得一条可能的倍半萜合酶基因，根据该基因的核苷酸序列，设计一对引物(上游引物：5`-ATGCCCGCTGCTCTCGTCTC-3`；下游引物：5`-TCATTGAATAGGGCG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种温郁金来源的倍半萜合酶，其特征在于所述酶的氨基酸序列为SEQ.ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种温郁金来源的倍半萜合酶，其特征在于所述酶的氨基酸序列为SEQ.IDNO.2所示。2.一种权利要求1所述温郁金来源的倍半萜合酶编码基因，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列为SEQ.IDNO.1所示。3.一种权利要求2所述温郁金来源的倍半萜合酶编码基因构建的重组载体。4.一种由权利要求3所述重组载体转化制备的重组基因工程菌。5.一种权利要求2所述温郁金来源的倍半萜合酶编码基因在制备温郁金来源的倍半萜合酶中的应用。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的应用为：将含有温郁金倍半萜合酶编码基因的重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌在含50mg/mL卡那霉素的LB培养基上37℃培养12h至OD600＝0.6，加入浓度为0.2mM的IPTG，25℃诱导表达15h，将诱导培养液分离纯化，获得含有重组倍半萜合酶的菌体细胞，采用镍柱进行亲和层析分离获得倍半萜合酶。7.一种权利要求1所述温郁金来源的倍半萜合酶在制备β-榄香烯中的应用。8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的应用为：以含温郁金来源的倍半萜合酶编码基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体超声破碎...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢恬，谌容，殷晓浦，
申请(专利权)人：杭州师范大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33