可注射的脱细胞软骨基质微粒及其在植入剂中的应用制造技术

本发明专利技术公开了可注射的脱细胞软骨基质微粒及其在植入剂中的应用，所述可注射的脱细胞软骨基质微粒，由软骨经漂洗，消毒，漂洗，反复冻融，切成薄片，浸泡，然后经脱细胞，冷冻干燥，低温研磨所得，其可进一步与植入辅料配合作为可注射的脱细胞软骨植入剂使用。本发明专利技术的基质微粒具备生物相容性好，结构成分为细胞自身的细胞外基质，有利于细胞的生长、增殖及分化，对细胞的形态、表型和细胞的运动具备生理作用。本发明专利技术的植入剂可作为微创注射整形植入材料，由于保留了软骨的天然三维立体结构以及大量的天然活性成分，即具填充功能又具组织修复功能。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于再生医学领域，具体涉及可注射的脱细胞软骨基质微粒及其在植入剂中的应用。
技术介绍
注射微整形技术在美容外科的应用迅猛发展，在颌面部软组织缺陷的修复治疗、隆鼻和隆下巴中也逐渐显示出其创伤小、恢复快的独特优势。无无论单独使用还是作为正颌、正畸修复手术的补充，微创注射技术在创伤重建，颌面部软组织缺陷修复、隆鼻和隆下巴中具有广阔的应用前景。牛胶原蛋白作为注射填充材料相关产品已获FDA批准。ZydermⅠ含3.5%牛胶原蛋白，适用于眶周、口周等浅表皱纹的浅层填充；ZydermⅡ含6.5%牛胶原蛋白，适合眉间皱纹、鼻唇沟、痤疮瘢痕等中度至深度皱纹的凹陷填充，因其胶原含量较高，注射后可能会出现暂时的隆起；Zyplast含3.5%的牛胶原蛋白，但经过戊二醛交联处理后韧性更强，更适合深度皱纹的填充。在注射后的维持时间上，ZydermⅠ/Ⅱ仅为2~4个月，因此注射时矫枉过正的手段是必要的（一般实际用量为需要量的1.5~2.0倍）；而化学交联则使Zyplast的保持时间也才4~6个月。但由于人体内胶原酶持续的降解作用，需要定期注射以达到良好的治疗效果。另外，首款HA填充材料含5.5mg/mL的交联透明质酸，于2004年获FDA批准用于治疗皮肤皱纹及凹陷性瘢痕，其Ⅲ期临床试验显示该产品极少出现并发症，包括过敏反应，但维持时间才5个月左右。中国专利CN200510044005.5公开了一种可注射软组织生物填充材料的制备方法；该方法采用猪皮经脱脂、脱细胞、戊二醛交联等工序，物理加工制的微粒。该专利制备微粒的方法只是将交联后材料通过物理方法切制为边长为300~500um的微粒，然而其微粒粒径过大，无法采用直径较小的针头注射；从而限制其在注射整形领域的实用价值。中国专利CN02156797.2公开了一种注射性胶原蛋白的制备方法及其产品和应用，该方法采用动物组织中的胶原蛋白纤维来制备注射性胶原蛋白，然而在制备过程中会破坏动物组织原有结构及其他成分，也损失了组织中具有生物活性或生物功能的活性成分，只能起到单纯的胶原蛋白填充作用。如上所述，目前已上市的一些美容整形植入材料及国内同类专利公开的美容整形植入材料制备方法均存在一定的缺点，尤其胶原和透明质酸植入剂产品，并未包含生物活性因子，因此其作用仅仅是填充，该类植入剂产品的美容效果是暂时性，当这些填充材料被机体逐渐分解吸收，美容修复效果就会减弱或消失。目前尚无采用脱细胞软骨为原料制备可注射充填材料的产品，亦无专利及文献报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可注射的脱细胞软骨基质微粒。本专利技术的另一目的在于提供一种可注射的脱细胞软骨基质植入剂。本专利技术所采取的技术方案是：可注射的脱细胞软骨基质微粒，由软骨按以下步骤制备而成：1）取动物软骨，去除其他肌肉及肌腱组织，漂洗，消毒，漂洗，反复冻融；2）将软骨切成薄片，然后置于0.5-3mM氯化钾溶液中浸泡3-6h；3）将所得软骨薄片置于含0.1~1MEDTA的0.001~0.1M氢氧化钠溶液中浸泡12~18h，漂洗，再置于含0.1~1MHCl的0.1~1M氯化钠溶液中浸泡5~10h，漂洗；4）重复步骤3），再将软骨薄片置于缓冲液中浸泡后，置于除垢剂中振荡萃取20~30h，漂洗；5）将软骨薄片置于缓冲液中浸泡，冷冻干燥，低温研磨，得可注射的脱细胞软骨基质微粒。优选的，所述消毒采用体积浓度为50~90%的乙醇水溶液和/或体积浓度为0.2~2%的过氧乙酸水溶液进行消毒。优选的，所述除垢剂为质量浓度为1~4％的曲拉通溶液。优选的，步骤2）氯化钾溶液的浓度为0.5-3mM。优选的，于氯化钾溶液中浸泡3-6h。优选的，所述反复冻融的方法：将软骨置于-80℃冰箱中冷冻0.5~3h，然后取出于37℃下解冻0.1~1h；反复冻融的次数：2~5次。优选的，优选的，低温研磨后，选粒径为20~200um的微粒，得可注射的脱细胞软骨基质微粒。由于所得脱细胞软骨基质微粒直径为20~200um，可使用25~27g小针头注射。优选的，所述漂洗采用缓冲液进行漂洗。优选的，所述缓冲液为PBS溶液。优选的，所述软骨为哺乳动物的软骨。优选的，所述软骨取自屠宰两小时内哺乳动物的软骨。优选的，所述步骤2）中将软骨切成厚度不大于2mm的薄片。优选的，步骤2）水中浸泡时间8~12h。优选的，步骤5）缓冲液中浸泡时间10~16h。优选的，步骤3）中每次浸泡时，软骨薄片与溶液的体积比为1：20~1:100。可注射的脱细胞软骨基质植入剂，含有上述的可注射的脱细胞软骨基质微粒、植入辅料，其中，所述可注射的脱细胞软骨基质微粒、植入辅料的质量体积比(m/v)g：mL为1:1~1:10。优选的，植入辅料包括磷酸盐缓冲液、生理盐水、自体富血小板血浆、聚电解质溶液中的至少一种。优选的，所述聚电解质溶液中的聚电解质为氧化纤维素、羧甲基甲壳素、羧甲基壳聚糖、羧甲基纤维素钠、透明质酸、硫酸软骨素、海藻酸钠、聚谷氨酸中的至少一种，其中，聚电解质溶液的浓度为0.5~40g/L，自体富血小板血浆以制备的浓度为准。优选的，植入辅料还包括细胞生长因子、利多卡因中的至少一种，其中，细胞生长因子终浓度为0.1~100mg/L，利多卡因终浓度为0.1~10g/L。可注射的脱细胞软骨基质植入剂可将组分混匀后灭菌灌装，使用时再混匀，也可将可注射的脱细胞软骨基质微粒、植入辅料分别灭菌灌装，使用时再混匀。本专利技术的脱细胞软骨基质微粒含有生物及细胞活性的细胞外基质成分，主要成分为脱细胞软骨基质中的二型胶原蛋白，其中还包含透明质酸及氨基多糖等软骨细胞外基质成分。本专利技术的有益效果是：本专利技术的脱细胞软骨基质微粒含有生物及细胞活性的细胞外基质成分，具备生物相容性好的优点，结构成分为细胞自身的细胞外基质，有利于细胞的生长、增殖及分化，对细胞的形态、表型和细胞的运动具备生理作用。本专利技术的脱细胞软骨基质植入剂作为微创注射整形植入材料，一方面，可作为在创伤、疾病或先天性畸形和美容的后续重建的组织替代或填充物，另一方面，保留了软骨的天然三维立体结构以及大量的天然活性成分，降低了美容注射产品在临床使用后因原料来源而引起的免疫排斥反应，适用于注射至皮下真皮层深层至皮下浅层以修复中度至重度皱纹、褶皱，填充，具有良好的美容修复效果。附图说明图1是可注射的脱细胞软骨基质微粒的SEM图（200um）；图2是可注射的脱细胞软骨基质微粒的SEM图（50um）；图3是可注射的脱细胞软骨基质微粒的SEM图（1um）；图4是成纤维细胞与植入剂复合培养后的普通光学显微镜下的观察图；图5是实验组植入剂植入大鼠皮下两周后的组织学切片效果观察的图；图6是实验组植入剂植入大鼠皮下四周后的组织学切片效果观察的图；图7是对照组植入剂植入大鼠皮下两周后的组织学切片效果观察的图；图8是对照组植入剂植入大鼠皮下四周后的组织学切片效果观察的图。具体实施方式下面结合具体的实施例对本专利技术作进一步的说明，但并不局限于此。实施例中所述溶液，如无特别说明，均指水溶液。实施例1可注射的脱细胞软骨基质微粒的制备方法，包括以下步骤：1）取牛的软骨，在PBS溶液中漂洗3次，用体积浓度为75%的乙醇水溶液对软骨进行消毒处理30分钟，在PBS溶液中漂洗3次，然后将软骨置于-80℃冰箱中冷冻2本文档来自技高网...

【技术保护点】
可注射的脱细胞软骨基质微粒，由软骨按以下步骤制备而成：1）取动物软骨，去除其他肌肉及肌腱组织，漂洗，消毒，漂洗，反复冻融；2）将软骨切成薄片，然后置于氯化钾溶液中浸泡；3）将所得软骨薄片置于含0.1~1MEDTA的0.001~0.1M氢氧化钠溶液中浸泡12~18h，漂洗，再置于含0.1~1MHCl的0.1~1M氯化钠溶液中浸泡5~10h，漂洗；4）重复步骤3），再将软骨薄片置于缓冲液中浸泡后，置于除垢剂中振荡萃取20~30h，漂洗；5）将软骨薄片置于缓冲液中浸泡，冷冻干燥，低温研磨，得可注射的脱细胞软骨基质微粒。

【技术特征摘要】
1.可注射的脱细胞软骨基质微粒，由软骨按以下步骤制备而成：1）取动物软骨，去除其他肌肉及肌腱组织，漂洗，消毒，漂洗，反复冻融；2）将软骨切成薄片，然后置于氯化钾溶液中浸泡；3）将所得软骨薄片置于含0.1~1MEDTA的0.001~0.1M氢氧化钠溶液中浸泡12~18h，漂洗，再置于含0.1~1MHCl的0.1~1M氯化钠溶液中浸泡5~10h，漂洗；4）重复步骤3），再将软骨薄片置于缓冲液中浸泡后，置于除垢剂中振荡萃取20~30h，漂洗；5）将软骨薄片置于缓冲液中浸泡，冷冻干燥，低温研磨，得可注射的脱细胞软骨基质微粒。2.根据权利要求1所述的脱细胞软骨基质微粒，其特征在于：所述消毒采用体积浓度为50~90%的乙醇水溶液和/或体积浓度为0.2~2%的过氧乙酸水溶液进行消毒。3.根据权利要求1所述的脱细胞软骨基质微粒，其特征在于：所述除垢剂为质量浓度为1~4％的曲拉通溶液。4.根据权利要求1所述的脱细胞软骨基质微粒，其特征在于：所述反复冻融的方法：将软骨置于-80℃冰箱中冷冻0.5~3h，然后取出于37℃下解冻0.1~1...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨伟红，程飚，王祥林，陈大鹏，邓小敏，刘江辉，
申请(专利权)人：广州昕生医学材料有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44