一种用于检测DNA错配修复系统的试剂盒及其用途技术方案

本发明专利技术公开了一种用于检测DNA错配修复系统的试剂盒及其用途，该试剂盒包含一扩增体系，该扩增体系包含PCR引物混合液和PCR反应液；所述的PCR引物混合液包含微卫星位点。本发明专利技术的试剂盒的微卫星位点具有更高的灵敏度和准确度，可以适用于检测不同的癌症，包括结肠直肠癌，子宫内膜癌，胃癌，胰腺癌，肺癌以及乳腺癌。本发明专利技术的含有用于检测DNA错配修复系统的微卫星位点的试剂盒的重复性更好，能够同时检测多个微卫星位点，提高了检测效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于DNA错配修复系统领域，具体涉及一种用于检测DNA错配修复系统的试剂盒及其用途。
技术介绍
人类基因组含有短串联DNA重复序列，又称作微卫星序列(microsatellite)，这些序列由于其重复性质，易发生复制错误，正常情况下，这些错误可以通过DNA的错配修复(MMR)系统来进行修复校正，DNA的MMR系统功能缺陷会引起微卫星不稳定性(microsatelliteinstability,MSI)，MSI是林奇综合症(Lynchsyndrome)的一个标志，在90％的林奇综合症中均有发生。微卫星不稳定表现为同一微卫星位点在不同个体之间以及同一个体的正常组织与某些异常组织之间，微卫星位点的重复单位的数目不同。近年来的大量研究表明：MSI与肿瘤发生密切相关，如结直肠癌、胃癌、子宫内膜癌等，MSI是癌症发生的一个生物标记。美国国立癌症协会建议50岁以下的结直肠癌患者应该做MMR检测，在国外一些医学中心对所有的结直肠肿瘤组织进行MMR蛋白免疫组化检测或者MSI检测，以决定哪些患者需要进行Lynch综合征相关基因检测。根据文献报道，大约15％的结直肠癌中存在MSI现象，与无MSI的结直肠癌相比，携带有MSI的结直肠癌其预后较好，已有大量证据表明，MMR蛋白表达缺失或者MSI-H是二期结直肠癌预后良好的一个标志物，而且存在MSI和无MSI的患者二者药物反应也不一样。此外，对于二期结直肠癌是否需要辅助化疗，临床上考量的一个重要信息就是微卫星不稳定性。因此，MSI检测对结直肠癌患者的意义重大。在2011年，关于结直肠癌筛查的美国国家综合癌症网指南(NCCNGuidelines)中，MSI已成为首要检测项目，推荐了5个检测位点用于MSI稳定性的确认，两个及两个以上位点发生变化为MSI-H，一个位点发生变化为MSI-L，没有位点发生变化为MSI-S。研究表明，二期/三期结肠癌患者发现MSI-L或者MSS通过辅助化疗确实会改善预后，但是MSI-H却不能从5-氟尿嘧啶(5-FU)辅助化疗中显著获益，5年生存率反而更低。结肠直肠癌是常见消化道恶性肿瘤，中国每年有13-16万人罹患结直肠癌，其中发病率占肿瘤发病率的第三位。具有MSI的散发性结直肠癌，具有不同的临床病理、分子生物学特征，表现为：发病年龄小；对某些化疗药物如5-FU、顺铂等有耐药性，MSI-H是二期结肠癌预后良好的一个标志物，也是患者不能从氟尿嘧啶单药辅助化疗获益的疗效预测指标。此外，检测MSI还可以辅助PD-1抗体用药。2015年的ASCO中报道，结肠癌MMR基因表达情况可以作为PD-1抗体治疗的疗效预测指标。根据大会临床数据报告，MMR表达缺陷(dMMR)患者PD-1治疗的有效率达到62％，相关的实验结果在2015年底发表在全球最顶尖的医学杂志NEJM上，引起了医学界的轰动。MMR基因的情况对PD-1结直肠癌疗效的预测精准度远远高于了之前通用的疗效预测指标B7-H1(PD-L1)。在美国和欧盟，NCCN已经将MSI检测纳入常规检测，但是在中国应用MSI检测的医院还非常少，用于结直肠癌筛查最常用的还是肠镜检查，粪便潜隐血检测，钡灌肠检测等。目前国内外用于检测MSI的方法主要有：(1)免疫组化方法(IHC)，主要检测MLH1，MSH2，MSH6，PMS2，这种方法不能检测MMR蛋白的生物学活性，所以有可能产生假阳性结果，而且IHC实验结果受抗体来源以及操作者的技能水平的影响，这会导致不同医院间结果的差异性，造成诊断不准确甚至是医疗纠纷；(2)直接测序法，对MMR基因各区域直接测序，这种方法耗时长，价格比较昂贵。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于检测DNA错配修复系统的试剂盒及其用途，该试剂盒的微卫星位点能够用于检测癌症DNA错配修复系统，其灵敏度比免疫组化方法(IHC)方法更高，本专利技术的试剂盒重复性更好，能够同时检测多个MSI位点，提高了检测效率。为了达到上述目的，本专利技术提供了一种用于检测DNA错配修复系统的试剂盒，该试剂盒包含一扩增体系，该扩增体系包含PCR引物混合液和PCR反应液；所述的PCR引物混合液包含微卫星位点，该微卫星位点包含：NR-21、NR-24、BAT-25、BAT-26、MONO-27、BAT-48、BAT-49a、BAT-49b、BAT-50a、BAT-50b、BAT-51a、BAT-51b、BAT-51c、BAT-51d、BAT-51e、BAT-51f、BAT-52a、BAT-52b、BAT-53a、BAT-53b、BAT-53c、BAT-54、BAT-55、BAT-56a、BAT-56b、BAT-57、BAT-59、BAT-59b、BAT-60a、BAT-60b、BAT-60c、BAT-62、BAT-63a、BAT-63b、BAT-68a、BAT-68b、BAT-69、BAT-72、BAT-73、BAT-79、BAT-83、BAT-90、BGT-60、PentaC、PentaD、PentaE中的任意一种或两种以上串联重复位点单核苷酸A或者G大于40个重复。所述的微卫星位点具体如下表所示：(AccessionNumber是Genebank的基因登录号)；上表中核苷酸重复表示有多少个重复的核苷酸；微卫星位点为1-6个碱基的串联重复序列，这些位点为单核苷酸A或者G串联重复位点，或者五个核苷酸串联重复位点，(A)21中A代表腺嘌呤核糖核苷酸，数字21代表重复21个A。所述的PCR引物混合液包含核苷酸序列SEQIDNO：1-92中的任意一种或两种以上。所述的核苷酸序列SEQIDNO：1-92的5’末端用荧光标记物标记，该荧光标记物包含FL(Fluorescein)、JOE(6-carboxy-4′,5′-dichloro-2′,7′-dimethoxyfluorescein)、TMR(carboxy-tetramethylrhodamine)、ROX(Carboxyl-X-Rhodamine)、ET-CXR(EnergyTransfer-carboxy-X-rhodamine)、ET-TMR(EnergyTransfer-carboxy-tetramethylrhodamine)或FAM(Fluoresceinamidite)中的任意一种或两种以上。所述的扩增体系还包含DNA模板，该扩增体系的组分的体积比为PCR反应液：PCR引物混合液：DNA模板：水＝1～2：1～2：1～4：2～7。所述的PCR反应液包括：10-100mMTris-HCl，10-250mMKCl，1-10mMMgCl2，0.1-10mMdNTP，0.1-10U/μLTaqDNA聚合酶。该检测方法采用荧光标记毛细管电泳法确定微卫星位点突变的存在。所述的突变包含：插入突变或缺失突变。本专利技术还提供了一种根据所述的用于检测DNA错配修复系统的试剂盒的用途，所述的微卫星位点能够用于检测DNA错配修复系统，该DNA错配修复系统包括癌症组织中的DNA错配修复系统。所述的癌症包括：结肠直肠癌，子宫内膜癌，胃癌，胰腺癌，肺癌，以及乳腺癌中的任意一种。所述的微卫星位点用于检测癌症的微卫星的不稳定性，使该试剂盒能作为检测癌症DNA错配修复系统的试剂盒。本专利技术提供的用于检本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测DNA错配修复系统的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含一扩增体系，该扩增体系包含PCR引物混合液和PCR反应液；所述的PCR引物混合液包含微卫星位点，该微卫星位点包含：NR‑21、NR‑24、BAT‑25、BAT‑26、MONO‑27、BAT‑48、BAT‑49a、BAT‑49b、BAT‑50a、BAT‑50b、BAT‑51a、BAT‑51b、BAT‑51c、BAT‑51d、BAT‑51e、BAT‑51f、BAT‑52a、BAT‑52b、BAT‑53a、BAT‑53b、BAT‑53c、BAT‑54、BAT‑55、BAT‑56a、BAT‑56b、BAT‑57、BAT‑59、BAT‑59b、BAT‑60a、BAT‑60b、BAT‑60c、BAT‑62、BAT‑63a、BAT‑63b、BAT‑68a、BAT‑68b、BAT‑69、BAT‑72、BAT‑73、BAT‑79、BAT‑83、BAT‑90、BGT‑60、Penta C、Penta D、Penta E中的任意一种或两种以上串联重复位点单核苷酸A或者G大于40个重复；所述的微卫星位点具体如下表所示：

【技术特征摘要】
1.一种用于检测DNA错配修复系统的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含一扩增体系，该扩增体系包含PCR引物混合液和PCR反应液；所述的PCR引物混合液包含微卫星位点，该微卫星位点包含：NR-21、NR-24、BAT-25、BAT-26、MONO-27、BAT-48、BAT-49a、BAT-49b、BAT-50a、BAT-50b、BAT-51a、BAT-51b、BAT-51c、BAT-51d、BAT-51e、BAT-51f、BAT-52a、BAT-52b、BAT-53a、BAT-53b、BAT-53c、BAT-54、BAT-55、BAT-56a、BAT-56b、BAT-57、BAT-59、BAT-59b、BAT-60a、BAT-60b、BAT-60c、BAT-62、BAT-63a、BAT-63b、BAT-68a、BAT-68b、BAT-69、BAT-72、BAT-73、BAT-79、BAT-83、BAT-90、BGT-60、PentaC、PentaD、PentaE中的任意一种或两种以上串联重复位点单核苷酸A或者G大于40个重复；所述的微卫星位点具体如下表所示：2.根据权利要求1所述的用于检测DNA错配修复系统的试剂盒，其特征在于，所述的PCR引物混合液包含核苷酸序列SEQIDNO：1-92中的任意一种或两种以上。3.根据权利要求1所述的用于检测DNA错配修复系统的试剂盒，其特征在于，所述的核苷酸序列SEQIDNO：1-92的5’末端用荧光标记物标记，该荧光标记物包含FL、JOE、TMR、ROX、ET-CX...

【专利技术属性】
技术研发人员：杰夫瑞·W·巴彻，张晓丽，段建涛，
申请(专利权)人：上海普洛麦格生物产品有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31