本发明专利技术公开了一种三七转录因子基因PnMYB1及其应用，PnMYB1基因具有SEQ ID NO:1所述的碱基序列,编码MYB类转录因子；本发明专利技术采用功能基因组学和代谢工程相关技术证明三七PnMYB1转录因子具有调控三七皂苷生物合成的功能；将本发明专利技术所述的三七PnMYB1转录因子基因构建到植物表达载体上并转入三七愈伤组织中使其过量表达，增强了三七皂苷合成途径中关键酶基因和三七中PnbHLH1转录因子表达量，提高了三七总皂苷和部分单体皂苷的含量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学以及基因工程领域，尤其是一种三七转录因子基因PnMYB1及其应用。
技术介绍
三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen为五加科人参属多年生草本植物，又名金不换、血参、人参三七、田七等，是我国特有的名贵中药材。三七在中国己有悠久的使用历史，在《本草纲目拾遗》、《跌损妙方》和《医门秘旨》中都有记载，被公认具有止血散瘀、消肿止痛、滋补强壮等功效。三七主要化学成分包括皂苷、类黄酮、多糖、甾醇和挥发油等，其中最主要的有效果成分为三七皂苷(saponinsofPanaxnotoginseng,PNS)。三七皂苷主要为四环三萜类皂苷，包括人参皂苷Rb1、Rg1、Rh1、Rd和Re等70余种，其具有扩张冠状动脉和外周血管、增加脑血流量的作用；还有抑制血小板凝聚、降低血液粘稠度、抑制血栓形成的功效；同时，兼具阵血脂、抗疲劳、耐缺氧，提高和增强巨噬细胞功能等作用。近年，三七的市场需求旺盛，但三七为多年生植物，对生境要求苛刻，产量难提高。强烈的供需矛盾使得利用生物工程技术和基因调控的方法来生产三七皂苷逐渐成为研究热点。茉莉酸甲酯(MeJA)为植物重要次级代谢信号分子，在植物抗逆自我保护过程中扮演重要角色，能够引起细胞次生代谢物的合成。越来越多的研究表明，控制重要萜类次生代谢物合成的转录因子大多能被茉莉酸甲酯诱导表达。转录因子是指能够特异性作用基因5’端上游启动子顺式作用元件的蛋白质，又称反式作用因子。其能通过调控RNA聚合酶与DNA模板的结合来激活或抑制某些基因转录。转录调控是植物次生代谢的重要环节，往往直接决定着代谢产物的合成。在植物中转录因子表达量的变化对其调控基因的表达量具有较大影响。因此，转录因子被作为改造植物代谢途径的有效工具，具有“多点调控”的优势，次生代谢途径中多个功能相关的酶基因常被同一转录因子正调控或负调控。例如在长春花中过表达转录因子ORCA3能够使D4H、STR、CPR和TDC等多个基因协同表达，显著提高长春花碱的含量。由于转录因子具“多点调控”的优点，通过生物工程技术和基因工程技术对转录因子进行基因修饰显然比多基因操作更容易改良目标次生代谢途径。MYB类转录因子在高等植物中广泛存在，为植物中最大的转录因子家族之一。MYB类转录因子的DNA结合结构域较保守，其由四个不完全的序列重复（R，分为R、R2、R3）组成，根据重复片段R的个数可将其分为四类：MYB-single（1R-MYB&MYB-related），R2R3-MYB，3R-MYB，4R-MYB。MYB-single主要参与植物细胞的形态发育和节律控制。R2R3-MYB为植物中含量最多的一类MYB转录因子，主要参与植物初生次生代谢的调控、生长发育以及对逆境刺激的响应等。3R-MYB主要参与调控细胞周期，4R-MYB功能报道较少尚不明确。MYB转录因子广泛参与植物苯丙烷、花青素、生物碱等次生代谢产物的生物合成，对萜类的调控报道较少，近年有报道，在云杉中超表达PtMYB14能够显著提高萜类的产量。长春花中超表达MYB类转录因子基因CrBPF1能够提高长春花中吲哚和萜类生物合成途径中相关酶基因的转录水平，调控吲哚生物碱和萜类的生物合成。说明仍然有少量参与萜类次生代谢的MYB转录因子存在。随着对植物次生代谢网络的深入解析和调控机制的阐明，特别是调节特定次生代谢物合成的转录因子的分离和鉴定，基于转录因子的基因工程将为开发利用植物次生代谢物提供更加有效的手段。本专利技术以体外培养的三七愈伤组织为研究对象，克隆PnMYB1转录因子基因，并对该转录因子进行分析和功能鉴定，明确PnMYB1转录因子在三七皂苷生物合成过程中的地位和作用，为获得高效、稳定的三七皂苷合成调控技术和同源或异源高效表达系统的建立提供理论参考和依据。
技术实现思路
本专利技术的目的是从三七中克隆获得可调控三七皂苷生物合成的转录因子基因PnMYB1以及明确该转录因子的应用，即在提高三七皂苷生物合成代谢途径中关键酶基因、转录因子基因PnbHLH1表达量和增加三七愈伤组织中总皂苷与部分重要单体皂苷含量的应用。本专利技术利用酵母单杂交法和cDNA末端快速扩增技术从三七中克隆到一个与MeJA诱导相关的MYB类转录因子基因并对其编码蛋白进行功能鉴定。专利技术人将其命名为PnMYB1，其中所述的cDNA片段如序列表SEQIDNO:1所示。对该基因进行序列分析，表明PnMYB1全长cDNA为1014bp，PnMYB1编码区是序列表SEQIDNO:1中第64-786位所示的核苷酸序列，具有723bp的开放阅读框(Openreadingframe，ORF)，63bp的5’非翻译区(untranslatedregion，UTR)和228bp的3’UTR，编码含有240个氨基酸的蛋白质，氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。通过农杆菌介导法将本专利技术的PnMYB1转录因子基因插入到植物表达载体pCAMBIA2300S多克隆位点所构建的重组载体转入到三七愈伤组织中，可提高三七皂苷合成途径中关键酶基因的表达量，使三七皂苷的含量增加。上述转录因子基因可以应用于正调控三七皂苷的生物合成，具体操作如下：（1）基因的获得：利用酵母单杂交方法筛选出三七中与MeJA诱导相关的MYB类转录因子，再利用cDNA末端快速扩增技术(3’RACE)获得PnMYB1的全长cDNA，设计特异性引物扩增PnMYB1的ORF框，然后将其连接到pGEM-T载体上，经测序验证获得具有目的基因的克隆；（2）植物表达载体构建与遗传转化：用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRI酶切pGEM-T-PnMYB1质粒，胶回收获得目的基因片段；用相同的限制性内切酶消化植物表达载体pCAMBIA2300S，胶回收载体大片段；将胶回收的目的基因片段与pCAMBIA2300S载体大片段连接，构建植物超表达载体pCAMBIA2300S-PnMYB1；利用液氮冻融法将pCAMBIA2300S-PnMYB1质粒转入农杆菌菌株EHA105中。通过农杆菌介导的遗传转化法，将PnMYB1导入三七愈伤组织中使其过表达。通过抗生素筛选、基因组DNAPCR和qRT-PCR筛选阳性转基因细胞系；（3）转基因细胞系总皂苷含量检测：提取三七非转基因和转基因细胞系中总皂苷，分析非转基因和转基因细胞系间总皂苷含量的差异，筛选出三七总皂苷含量得已提高的阳性转基因细胞系；（4）转基因细胞系部分重要单体皂苷含量检测：制备三七非转基因和总皂苷含量得到提高的转基因细胞系的皂苷溶液，利用HPLC法对非转基因和转基因细胞系中的重要部分单体皂苷含量进行测定，分析非转基因和转基因细胞系间单体皂苷含量的差异，最后筛选出单体皂苷含量得到提高的阳性转基因细胞系。本专利技术为提高三七中皂苷的含量提供了一种新方法，利用生物工程技术和基因调控的方法可更高效率合成三七皂苷，克服了人工栽培周期长、化学合成机理和路线不够清晰等缺点；将转录因子PnMYB1基因导入三七细胞中表达，使三七皂苷生物合成途径关键酶基因的表达量提高，增加了三七皂苷的产量，为大规模产业化生产三七皂苷提供了理论参考和科学依据。附图说明图1为本专利技术中三七总RNA电泳图谱；图2为本专利技术中纯化mRNA电泳图谱，其中M为DL2000DN本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种三七转录因子基因PnMYB1，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO︰1所述。
【技术特征摘要】
1.一种三七转录因子基因PnMYB1，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO︰1所述。2.权利要求1所述的三七转录因子基因Pn...
【专利技术属性】
技术研发人员：葛锋，邓兵，黄壮嘉，刘迪秋，陈朝银，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南;53
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