重组干扰素α1的产业化制备方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种重组猪干扰素α1(rpIFNα1)的大肠杆菌表达、包涵体变复性及纯化的产业化生产方法。具体涉及到：1、rpIFNα1大肠杆菌表达菌株的构建；2、rpIFNα1高密度发酵工艺开发；3、rpIFNα1包涵体变性和复性工艺开发；4、复性后rpIFNα1样品的纯化制备。通过以上4个层面的技术攻关，本发明专利技术方法生产的rpIFNα1具有较高的生物活性，且该方法产量高、成本低廉、易于放大。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程与蛋白纯化领域，具体涉及一种重组猪干扰素α1(rpIFNα1)的大肠杆菌表达、包涵体变复性及纯化的产业化生产的方法。
技术介绍
干扰素(Interferon,IFN)是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子，它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。根据IFN抗原性不同，可分为IFNα、IFNβ、IFNγ三种。其中IFNα是免疫细胞通过抗病毒应答反应而产生的一组结构类似、功能接近的低分子糖蛋白，它具有显著的抗病毒、抗肿瘤、抑制造血细胞增殖和免疫调节等功能，适用于病毒感染性疾病(如肝炎)、骨髓增生性疾病、淋巴细胞系肿瘤及其它肿瘤等疾病的治疗。我国是养猪大国，猪病毒性传染病种类多、危害大，虽然目前我国普遍接种猪病疫苗，但仍然不能很好的控制疫病。随着动物保健的迫切需求和生物工程技术的不断发展，各种动物用干扰素的生产方法成为近年来的研究热点。唯一获得农业部“新兽药证书”和“生产批准文号”的猪干扰素是“猪白细胞干扰素”，它是通过病毒刺激细胞产生的活性蛋白混合物，存在单位体积活性效价低和猪血潜在病毒污染的问题。基因工程rpIFNα1具有广泛的抗病毒效应，并且具有无副作用、无药物残留等优点，在兽药领域具有广泛的应用前景。大肠杆菌表达系统是目前应用最为广泛的外源蛋白表达系统，为了获得更高的蛋白产量研究人员开发了高密度发酵方法，但在高密度发酵过程中由于菌体密度较高往往会导致发酵复合培养基成本高、DO控制困难等问题。针对这些问题，菌株构建、发酵过程的控制、发酵培养基的筛选就显得尤为重要。此外，使用大肠杆菌作为真核生物来源蛋白的表达宿主时，由于大肠杆菌的高效表达、匮乏的蛋白翻译和修饰等多种因素导致真核蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式进行表达。包涵体是一种无活性的蛋白聚集体，需要进行人工复性才能获得相应的生理活性。而包涵体的复性是一个非常复杂的过程，不仅与蛋白质复性的过程控制密切相关，还很大程度上取决于目的蛋白的自身性质。如果复性条件不适宜将会出现分子内二硫键的错配，分子间共价结合或疏水结合形成聚合体，降低重组蛋白的比活率，造成产品质量不合格，同时又易产生沉淀析出，影响得率。
技术实现思路
因此本专利要解决的四个技术层面的问题是：1、构建符合药用蛋白要求的rpIFNα1大肠杆菌表达菌株，实现高效表达；2、开发产量高、成本低廉、易于放大的rpIFNα1大肠杆菌菌株高密度发酵工艺；3、研发rpIFNα1包涵体的变性和复性工艺；4、确立易于放大、成本低廉、工艺简单的纯化方法，制备高纯度、高生物活性的rpIFNα1。本专利技术目的之一在于提供一种rpIFNα1大肠杆菌的高密度发酵表达方法，该方法包括：发酵种子活化、发酵一级种子液制备、发酵二级种子液制备、高密度发酵。所述的高密度发酵包括如下步骤：将二级种子液按照5-15％的接种量接入到含灭菌后的分批发酵培养基发酵罐中；设定发酵温度为37℃、pH为6.8-7.2之间、DO设定在30-40％之间；发酵开始后定期取样进行OD600和菌体湿重的测定，待DO曲线出现急剧上升的时候表明分批培养基中葡萄糖耗尽，开始加入补料培养基进行补料培养；待菌体生长至0D600≈45-55之间向发酵罐中加入终浓度为0.5-1.0mM/L的IPTG在37℃进行诱导表达；诱导表达4-6h结束培养。所述分批发酵培养基成分包括：一水合柠檬酸0.5-3g/L，磷酸二氢钾8-15g/L，磷酸氢二铵3-7g/L，葡萄糖10-20g/L，七水合硫酸镁1.5-3g/L。在发酵接种之前还要向分批发酵培养基中加入1/1000(V/V)的微量元素母液用于维持菌体正常生长和代谢。所述微量元素母液成分包括：FeSO4·7H2O10g/L、ZnSO4·7H2O2.25g/L、CuSO4·5H2O15g/L、MnSO4·5H2O5g/L、CaCl2·7H2O1g/L、CoCl·6H2O1g/L、Na2MoO4·2H2O1.125g/L、H3BO30.0625g/L、HCl41.75ml、Biotin0.5g/L。所述补料培养基主要成分包括：甘油1024g/L，七水合硫酸镁8-12g/L，在补料开始之前还要补料培养基中加入1/1000(V/V)的上述微量元素母液用于维持菌体正常生长和代谢。所述补料培养基的流加速度维持在25-30g/h之间。DO是发酵过程中重要监控参数之一，对于有氧培养而言大肠杆菌的生长代谢需要氧气的参与，同时发酵液中的氧浓度变化也是发酵过程监测和菌体生长情况的重要反馈信号之一。例如，在分批培养结束时要进行补料培养，而补料开始的信号则是DO的突然上升。一般而言，发酵液DO过低会造成菌体的生长缓慢、质粒丢失、蛋白产量低的问题；发酵液中DO过高则会导致菌体生长过快、代谢负荷过重、质粒丢失、蛋白产量低、能耗增大等问题。因此，控制发酵过程中的DO在合理区间是保证发酵结果的必要手段。一般情况下，对于高密度发酵而言，发酵的前期菌体代谢较慢可以通过提高转速和空气通气量来保证DO的稳定。随着菌体生长代谢趋于旺盛耗氧量随之提高，此时通过提高转速(转速过高会导致剪切力过大、菌体死亡及质粒丢失)和空气通气量无法满足对氧气的需求，因此需要通入纯氧以起到维持DO的作用。对于高密度发酵后期，随着生物量的增大，发酵液趋于粘稠，氧气传质下降，DO的控制会更加困难，此时氧气对于DO维持就更为重要。本专利技术通过转速/空气/高纯氧三者的关联将DO控制在30-40％之间，具体来说就是，设定DO为30-40％，通过发酵罐控制系统在发酵初期设定空气通气量为0.5-3L/min，然后通过逐渐提高转速(不超过900转)以维持DO稳定。当调节转速和空气量不足以维持DO在30-40％左右时，通过逐渐提高高纯氧的通气量来稳定DO。所述发酵种子活化方法具体为：将构建好的rpIFNα1大肠杆菌菌株冻存管使用三区划线的方法接种到LB固体培养基中，37℃过夜培养进行活化。所述发酵一级种子液制备方法为：从固体培养基上挑取形状饱满、大小适中的单菌落接种到LB液体培养基中，37℃，220rpm摇床培养8-10h，此为一级种子液。所述发酵二级种子液制备方法为：将一级种子液按照1％的接种量转接到新鲜的LB液体培养基中，37℃，220rpm摇床培养至OD600≈3-5之间，此为二级种子液。上述任何用于菌体培养的器皿和培养基在使用前均应进行过滤或者湿热灭菌，任何培养基在灭菌结束冷却后使用前均应加入终浓度为50μg/ml的卡那霉素以保证纯种培养。本专利技术目的之二在于提供一种rpIFNα1包涵体变性前预纯化的处理方法，通过该方法可以去除rpIFNα1包涵体中部分杂蛋白、核酸、脂类等杂质，降低下游纯化成本，提高最终纯化效果，还可以减少杂质对于复性过程的影响。包括如下步骤：(1)菌体破碎收集后的rpIFNα1包涵体固体颗粒使用bufferB(20-100mMTris、0.5-5mMEDTA、100-300mM氯化钠、1mMPMSF、0.5-2％TritonX-100，盐酸调节pH8.0)重悬至10-25g/L，室温搅拌处理5h，10000g/15min离心收集包涵体沉淀丢弃上清液，重复操作2次；本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组猪干扰素α1的制备方法，为重组猪干扰素α1大肠杆菌的高密度发酵表达，包括发酵种子活化、发酵一级种子液制备、发酵二级种子液制备、高密度发酵；所述的高密度发酵包括如下步骤：将二级种子液按照5‑15％的接种量接入到含灭菌后的分批发酵培养基发酵罐中；设定发酵温度为37℃、pH为6.8‑7.2之间、DO设定在30‑40％之间；发酵开始后定期取样进行OD600和菌体湿重的测定，待DO曲线出现急剧上升的时候表明分批培养基中葡萄糖耗尽，开始加入补料培养基进行补料培养；待菌体生长至0D600≈45‑55之间向发酵罐中加入终浓度为0.5‑1.0mM/L的IPTG进行诱导表达；37℃诱导表达4‑6h结束培养。

【技术特征摘要】
1.重组猪干扰素α1的制备方法，为重组猪干扰素α1大肠杆菌的高密度发酵表达，包括发酵种子活化、发酵一级种子液制备、发酵二级种子液制备、高密度发酵；所述的高密度发酵包括如下步骤：将二级种子液按照5-15％的接种量接入到含灭菌后的分批发酵培养基发酵罐中；设定发酵温度为37℃、pH为6.8-7.2之间、DO设定在30-40％之间；发酵开始后定期取样进行OD600和菌体湿重的测定，待DO曲线出现急剧上升的时候表明分批培养基中葡萄糖耗尽，开始加入补料培养基进行补料培养；待菌体生长至0D600≈45-55之间向发酵罐中加入终浓度为0.5-1.0mM/L的IPTG进行诱导表达；37℃诱导表达4-6h结束培养。2.根据权利要求1所述的重组猪干扰素α1的制备方法，其特征在于所述分批发酵培养基成分包括：一水合柠檬酸0.5-3g/L，磷酸二氢钾8-15g/L，磷酸氢二铵3-7g/L，葡萄糖10-20g/L，七水合硫酸镁1.5-3g/L。3.根据权利要求1所述的重组猪干扰素α1的制备方法，其特征在于在发酵接种之前还要向分批发酵培养基中加入1/1000(V/V)的微量元素母液，所述微量元素母液成分包括：FeSO4·7H2O10g/L、ZnSO4·7H2O2.25g/L、CuSO4·5H2O15g/L、MnSO4·5H2O5g/L、CaCl2·7H2O1g/L、CoCl·6H2O1g/L、Na2MoO4·2H2O1.125g/L、H3BO30.0625g/L、HCl41.75ml、Biotin0.5g/L。4.根据权利要求1所述的重组猪干扰素α1的制备方法，其特征在于所述补料培养基主要成分包括：甘油1024g/L，七水合硫酸镁8-12g/L，在补料开始之前还要补料培养基中加入1/1000(V/V)的如权利要求3所述的微量元素母液。5.根据权利要求1所述的重组猪干扰素α1的制备方法，其特征在于DO通过下述方法稳定在30-40％：发酵初期设定空气通气量为0.5-3L/min，然后通过逐渐提高转速(不超过900转)以维持DO稳定；当调节转速和空气量不足以维持DO在30-40％左右时，通过逐渐提高高纯氧的通气量来稳定DO。6.根据权利要求1所述的重组猪干扰素α1的制备方法，还包括重组猪干扰素α1包涵体变性前预纯化，包括如下步骤：(1)权利要求1中诱导表达结束后的菌体离心破碎；(2)菌体破碎收集后的...

【专利技术属性】
技术研发人员：马永，赵百学，王安良，
申请(专利权)人：江苏众红生物工程创药研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32