一种荧光生物探针及其检测Hg制造技术

本发明专利技术属于检测领域，具体涉及一种荧光生物探针、包含该荧光生物探针的生物检测系统及其检测Hg

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于检测领域，具体涉及一种荧光生物探针、包含该荧光生物探针的生物检测系统及其检测Hg2+浓度的方法。
技术介绍
汞是最具毒性和最危险的重金属元素之一，通过食物链在生物体内累积，给人们带来了严重的健康危害，如生长发育缓慢、器官损伤、神经系统损伤，甚至死亡。美国环保署(USEPA)规定的饮用水中汞离子(Hg2+)的含量最高不超高10nmol/L。因此，有必要发展一种高选择性和高灵敏性的分析方法用于环境中汞离子的检测。近来，Ono等人证明了Hg2+能够高特异性和高选择性的嵌入DNA的两个胸腺嘧啶(T)中间，形成T-Hg2+-T的错配碱基对(MiyakeY,TogashiH,TashiroM,etal.MercuryII-mediatedformationofthymine-HgII-thyminebasepairsinDNAduplexes[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety,2006,128(7):2172-2173.)，基于这一特性，通过结合一些信号转换策略，发展了许多不同的检测方法，如比色法(ZhuY,CaiY,ZhuY,etal.HighlysensitivecolorimetricsensorforHg2+detectionbasedoncationicpolymer/DNAinteraction[J].BiosensorsandBioelectronics,2015,69:174-178.)、荧光法(YuanM,ZhuY,LouX,etal.Sensitivelabel-freeoligonucleotide-basedmicrofluidicdetectionofmercury(II)ionbyusingexonucleaseI[J].BiosensorsandBioelectronics,2012,31(1):330-336.)、电化学法(XuanF,LuoX,HsingIM.Conformation-dependentexonucleaseIIIactivitymediatedbymetalionsreshufflingonthymine-richDNAduplexesforanultrasensitiveelectrochemicalmethodforHg2+detection[J].AnalyticalChemistry,2013,85(9):4586-4593.)等，但是上述方法的检出下限一般都高于10nmol/L，无法满足实际需求。为了提高检测灵敏度，可以使用不同的酶来实现信号放大，如核酸外切酶(ChenJ,ZhouS,WenJ.DisposablestripbiosensorforvisualdetectionofHg2+basedonHg2+-triggeredtoeholdbindingandexonucleaseIII-assistedsignalamplification[J].AnalyticalChemistry,2014,86(6):3108-3114.)、聚合酶(JiaH,WangZ,WangC,etal.Real-timefluorescencedetectionofHg2+ionswithhighsensitivitybyexponentiallyisothermaloligonucleotideamplification[J].RSCAdvances,2014,4(19):9439-9444.)、核酸内切酶(LiF,FengY,LiuS,etal.Triggeredactivityofanickingendonucleaseformercuric(II)ion-mediatedduplex-likeDNAcleavage[J].ChemicalCommunications,2011,47(22):6347-6349.)、连接酶(BiS,JiB,ZhangZ,etal.Metalionstriggeredligaseactivityforrollingcircleamplificationanditsapplicationinmolecularlogicgateoperations[J].ChemicalScience,2013,4(4):1858-1863.)等，但基于酶的方法不仅增加了实验的复杂性和检测成本，而且Hg2+还有可能使酶变性，实际中难以应用。因此，开发一种灵敏度更高、操作简便快捷且成本低廉的Hg2+浓度检测方法，具有重要的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种荧光生物探针，本专利技术的荧光生物探针可以检测浓度低至50-1200pM的Hg2+，且操作简单快捷、成本低廉，能够广泛应用于药品、食品安全、临床和环境检测等领域。本专利技术的另一个目的是提供一种用于Hg2+检测的荧光生物检测系统，其特征在于包括本专利技术的荧光生物探针、辅助DNA和氧化石墨烯(GO)。本专利技术的还一个目的是提供一种检测Hg2+浓度的生物检测方法。为实现上述专利技术目的，提供以下技术方案：一种荧光生物探针，由三种核酸片段H1、H2和H3组成，其中H1、H2和H3的5’端标记荧光基团FAM，H1、H2和H3的碱基序列见图9，H1、H2和H3在游离状态下各自形成茎环的发卡结构，H1、H2、H3环部10个碱基，茎部15对互补碱基，末端单链10个碱基，H1、H2和H3的5’末端单链吸附在氧化石墨烯表面，荧光淬灭，在Hg2+存在下，辅助DNA可以催化吸附于氧化石墨烯表面的H1、H2和H3组装生成”Y”字形刚性双链DNA(dsDNA)结构，脱离石墨烯表面，恢复荧光信号。根据本专利技术，所述的荧光生物探针H1、H2和H3的发卡结构可以通过95℃下搅拌5min获得。第二方面，本专利技术提供一种用于Hg2+检测的荧光生物检测系统，包括本专利技术的荧光生物探针，辅助DNA和氧化石墨烯，其特征在于所述的荧光生物探针由三种核酸片段H1、H2和H3组成，其中H1、H2和H3的5’端标记荧光基团FAM，H1、H2和H3的碱基序列见图9，H1、H2和H3在游离状态下各自形成茎环的发卡结构，H1、H2、H3环部10个碱基，茎部15对互补碱基，末端单链10个碱基；所述的辅助DNA是由20个碱基组成的DNA片段，碱基序列见图9；所述的氧化石墨烯可以采用修饰的Hummer法等方法合成制备。本专利技术的荧光生物探针H1、H2和H3的5’末端单链吸附在氧化石墨烯表面，荧光淬灭，在Hg2+存在下，辅助DNA可以催化吸附于氧化石墨烯表面的H1、H2和H3组装生成”Y”字形刚性双链DNA(dsDNA)结构，脱离石墨烯表面，恢复荧光信号。根据本专利技术的荧光生物检测系统，所述的荧光生物探针H1、H2和H3的发卡结构可以通过95℃下搅拌5min获得。根据本专利技术的荧光生物检测系统，其中荧光生物探针H1、H2和H3为浓度30-200nmol/L的H1、H2和H3Tris-HCl缓冲溶液。优选地，荧光生物探针H1、H2和H3为浓度50-200nmol/L的H1、H2和H3Tris-HCl缓冲溶液。进一步优选地，荧光生物探针H1、H2和H3为浓度50nmol/L的H1、H2和H3Tris本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种荧光生物探针，由三种核酸片段H1、H2和H3组成，其中H1、H2和H3的5’端标记荧光基团FAM，H1的碱基序列为5’‑FAM‑ATGTGCCATTCACTCAACTTCATCACACATTCAACTGATGAAGTTGAGTG‑3’、H2的碱基序列为5’‑FAM‑CACTCAACTTCATCAGTTGAATGTGGAGTGAATGGCACATTCAACTGATG‑3’、H3的的碱基序列为5’‑FAM‑CATCAGTTGAATGTGCCATTCACTCTGATGAAGTTGAGTGAATGGCACAT‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种荧光生物探针，由三种核酸片段H1、H2和H3组成，其中H1、H2和H3的5’端标记荧光基团FAM，H1的碱基序列为5’-FAM-ATGTGCCATTCACTCAACTTCATCACACATTCAACTGATGAAGTTGAGTG-3’、H2的碱基序列为5’-FAM-CACTCAACTTCATCAGTTGAATGTGGAGTGAATGGCACATTCAACTGATG-3’、H3的的碱基序列为5’-FAM-CATCAGTTGAATGTGCCATTCACTCTGATGAAGTTGAGTGAATGGCACAT-3’。2.根据权利要求1所述的荧光生物探针，H1、H2和H3在游离状态下各自形成茎环的发卡结构，H1、H2、H3环部10个碱基，茎部15对互补碱基，末端单链10个碱基。3.一种荧光生物检测系统，其包括权利要求1或2所述的荧光生物探针，辅助DNA和氧化石墨烯，所述辅助DNA的碱基序列为5’-TGTTGTTGTTGTGTGTTTGG-3’。4.根据权利要求3的荧光生物检测系统，其中所述的荧光生物探针为浓度30-200nmol/L的H1、H2和H3Tris-HCl缓冲溶液；优选地，所述的荧光生物探针为浓度50-200nmol/L的H1、H2和H3Tris-HCl缓冲溶液；进一步优选地，所述的荧光生物探针为浓度50nmol/L的H1、H2和H3Tris-HCl缓冲溶液。5.根据权利要求3的荧光生物检测系统，其中所述的辅助DNA为浓度20-500nmol/L的辅助DNATris-HCl缓冲溶液；优选地，所述的辅助DNA为浓度100-500nmol/L的辅助DNATris-HCl缓冲溶液；进一步优选地，所述的辅助DNA为浓度100nmol/L的辅助DNATris-HCl缓冲溶液。6.根据权利要求3的荧光生物检测系统，其中所述的氧化石墨烯采用修饰的Hummer方法制备，浓度为99μg/mL。7.一种Hg2+浓度的生物检测方法，所述方法包括如下步骤：(1)室温下，将待测品、荧光生物探针的Tris-HCl缓冲溶液以及辅助DNA的Tris-HCl缓冲溶液混合，搅拌时间T1后，加入氧化石墨烯继续搅拌时间T2；(2)测定步骤(1)所得物的荧光发射光谱强度，根据荧光强度-Hg2+浓度标准曲线得到...

【专利技术属性】
技术研发人员：云雯，吴虹，刘兴燕，尤琳烽，蔡定洲，黄昱，
申请(专利权)人：重庆工商大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50