一种诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的引物组、含有该引物组的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种诊断猪猪脐带血猪瘟病毒野毒株的引物组、含有该引物组的试剂盒及其应用。诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的引物如SEQ ID NO:1‑SEQ ID NO:4所示。本发明专利技术的引物组还可用于制备诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的试剂盒，所述试剂盒包括外套引物、内套引物、阴性对照、阳性对照、2×PCR Mixture。本发明专利技术的引物组以及包含该引物组的试剂盒能够特异性地诊断猪脐带血病毒野毒株，并能特异性区分猪瘟疫苗毒和猪瘟病毒野毒，而且能将猪瘟病毒与牛病毒性黏膜腹泻病毒和羊边界病毒区分开来，并具有较高的灵敏度，可重复性好，检测结果真实可靠。该方法检测过程简便，检测时间短，结果判定简单。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别涉及一种诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的引物组、含有该引物组的试剂盒及其应用。
技术介绍
猪瘟病毒(CSFV)是属于黄病毒科、瘟病毒属的成员。猪瘟病毒具有高度传染性和致病性，会引发猪只大量死亡而造成养猪业的严重损失。猪只从感染猪瘟病毒至显示临床症状前，就可能排出大量病毒。若动物耐过急性或亚急性感染，会产生抗体或转为慢性感染病例，后者终其一生会持续性或间歇性的排毒，直到死亡为止。若怀孕母猪感染猪瘟病毒，病毒可穿过胎盘感染胎儿，导致流产、木乃伊胎或死产。如果感染发生在怀孕中期(约第50-70天)，可能产出弱仔或持续性毒血症的仔猪。这些持续性感染的仔猪会因为本身无法产生正常的免疫反应来对抗病毒(免疫耐受)，而成为持续传播病毒的传染源。目前常用血清学(ELISA)方法诊断猪瘟病毒野毒株，但是血清学检测方法是抗原和抗体反应，仅检测1次无法准确判断猪群的感染状况和排毒状况；血清学检测抗体，检测的抗体水平高低无法定量检测分析，血清学仅能评价机体体液免疫产生的水平；血清学评估猪群健康度、对无症状带毒和免疫耐受的猪群评估存在技术上的瓶颈；血清学需要采集前腔静脉血，血样采集相对费力、费时、且需要特殊设备辅助，多人协助。聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)扩增技术作为最基本的基因扩增技术，现在广泛应用于分子生物学的各个领域，在病毒诊断领域也得到了广泛的应用。然而其扩增结果受限于检测对象的模板含量，当模板量很少时，常常获得阴性结果。在猪脐带血猪瘟病毒诊断领域，猪脐带血中的猪瘟病毒量通常很低，使用传统的常规PCR检测技术通常由于其灵敏度不够而出现假阴性结果，无法满足要求。巢式PCR扩增技术是一种建立在常规PCR技术上的新技术，其设计两套PCR引物(巢式引物)对模板进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，以此扩增产物作为模板用内引物进行第二轮扩增。由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性(因为与两套引物都互补的模板很少)因而增加了检测的敏感性，同时又有两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性。胎盘(Placenta)通常是指尿膜绒毛膜与子宫黏膜发生联系所形成的结构，包括两部分，即尿膜绒毛膜的绒毛部分为胎儿胎盘，子宫黏膜部分为母体胎盘。胎儿的血管和子宫血管各自分布到自己的胎盘部分上去，但并不直接相通。脐带血通常是指胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液。在实际生产中，快速精准检测脐带血中的猪瘟病毒野毒株难度相对很大，急需建立一种快速的脐带血猪瘟病毒野毒株的诊断方法，不仅可以对母猪疫苗株的安全评价及仔猪疾病的快速准确诊断，及时制定防控计划，具有十分重要的临床意义，而且可根据脐带血检测结果评估猪群CSFV野毒感染状况，开展猪瘟疾病的净化，达到规模化猪瘟野毒感染为阴性。因此，亟待建立一种可以精准诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的方法。巢式PCR连续使用两个PCR反应体系进行两轮PCR扩增，特别在第二轮PCR扩增时反应体系中同时存在2对引物，引物与引物之间发生连接引起非特异性扩增。因此，采用巢式PCR方法诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株，关键是需要根据Genbank发布的这些病毒全基因组或部分序列的保守序列，设计得到特异性引物，并避免引物与引物之间发生连接引起非特异性扩增。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提出一种诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的引物组、含有该引物组的试剂盒及其应用，利用本专利技术的引物组所建立的巢式PCR方法具有灵敏度高、特异性好、可重复性好、检测结果快速客观准确等优点，可以快速诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株。基于上述目的，本专利技术提供的一种诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的引物组，所述引物组由内外两套引物组成，外套引物由外套上游引物和外套下游引物组成，内套引物由内套上游引物和内套下游引物组成，各引物的核苷酸序列如下所示：外套上游引物：5’-AGRCCAGACTGGTGGCCNTAYGA-3’，其为SEQIDNO:1序列；外套下游引物：5’-TTYACCACTTCTGTTCTCA-3’，其为SEQIDNO:2序列；内套上游引物：5’-TCRWCAACCAAYGAGATAGGG-3’，其为SEQIDNO:3序列；内套下游引物：5’-CACAGYCCRAAYCCRAAGTCATC-3’，其为SEQIDNO:4序列。上述引物序列中简并碱基R表示A或G碱基，N表示A、C、G或T碱基，Y表示T或C碱基，W表示A或T碱基。本专利技术还提供了所述的诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的引物组在制备诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株试剂中的应用。进一步的，本专利技术还提供了一种诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的试剂盒，所述试剂盒包含所述的引物组。在本专利技术中，优选的，外套上游引物和外套下游引物的摩尔比为1:1；内套上游引物和内套下游引物的摩尔比为1:1。在本专利技术中，优选的，所述试剂盒还包括阴性对照、阳性对照、2×PCRMixture。在本专利技术中，优选的，所述阴性对照为无DNA酶的ddH2O；所述阳性对照为含有猪瘟病毒E2基因片段的克隆质粒pEASY-T1-CSFV671，阳性对照pEASY-T1-CSFV671质粒的终浓度范围为1.0×106copies/μl～1.0×107copies/μl。在本专利技术中，优选的，所述猪瘟病毒E2基因片段的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示，目的片段为272bp。在本专利技术中，优选的，所述克隆质粒采用以下方法制备得到：利用SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物序列扩增猪瘟病毒E2基因片段，回收片段与pEASY-T1载体连接，筛选阳性克隆，测序正确的克隆质粒命名为pEASY-T1-CSFV671。进一步的，本专利技术还提供了所述的诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的试剂盒在制备诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株试剂中的应用。更进一步的，本专利技术还提供了所述的诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：a.采集经猪瘟疫苗免疫的同一头母猪分娩的所有同窝仔猪的脐带血，同窝仔猪的脐带血混合后作为样品；b.提取步骤a中的样品的RNA；c.以步骤b得到的RNA为模板，使用逆转录试剂盒通过逆转录，得到cDNA；d.以步骤c得到的cDNA为模板，采用SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物序列经过PCR扩增得到第一轮PCR扩增产物；e.以步骤d得到的第一轮PCR扩增产物的稀释液为模板，采用SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的引物序列经过PCR扩增得到第二轮PCR扩增产物；f.采用琼脂糖凝胶电泳法对第二轮PCR扩增产物进行分析：①有扩增产物，扩增产物长度为272bp，且阴性对照和阳性对照均成立，则表明所检测的脐带血样品中有猪瘟病毒野毒感染；②没有扩增产物，且阴性对照和阳性对照均成立，则表明所检测的脐带血样品中没有猪瘟病毒野毒感染，猪瘟疫苗免疫成功。在本专利技术中，优选的，第一轮PCR扩增时，PCR反应体系以25μL计为：10umol/LSEQIDNO:1所示的上游引物：0.5μL；10umol/LSEQIDNO:2所示的下游引物：0.5μL；2×PCRMixture：12.5μL；200ng/μL的cDNA模板：本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的引物组，其特征在于，所述引物组由内外两套引物组成，外套引物由外套上游引物和外套下游引物组成，内套引物由内套上游引物和内套下游引物组成，各引物的核苷酸序列如下所示：外套上游引物：5’‑AGRCCAGACTGGTGGCCNTAYGA‑3’，其为SEQ ID NO:1序列；外套下游引物：5’‑TTYACCACTTCTGTTCTCA‑3’，其为SEQ ID NO:2序列；内套上游引物：5’‑TCRWCAACCAAYGAGATAGGG‑3’，其为SEQ ID NO:3序列；内套下游引物：5’‑CACAGYCCRAAYCCRAAGTCATC‑3’，其为SEQ ID NO:4序列；其中，兼并碱基R表示A或G碱基，N表示A、C、G或T碱基，Y表示T或C碱基，W表示A或T碱基。

【技术特征摘要】
1.一种诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的引物组，其特征在于，所述引物组由内外两套引物组成，外套引物由外套上游引物和外套下游引物组成，内套引物由内套上游引物和内套下游引物组成，各引物的核苷酸序列如下所示：外套上游引物：5’-AGRCCAGACTGGTGGCCNTAYGA-3’，其为SEQIDNO:1序列；外套下游引物：5’-TTYACCACTTCTGTTCTCA-3’，其为SEQIDNO:2序列；内套上游引物：5’-TCRWCAACCAAYGAGATAGGG-3’，其为SEQIDNO:3序列；内套下游引物：5’-CACAGYCCRAAYCCRAAGTCATC-3’，其为SEQIDNO:4序列；其中，兼并碱基R表示A或G碱基，N表示A、C、G或T碱基，Y表示T或C碱基，W表示A或T碱基。2.根据权利要求1所述的诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的引物组在制备诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株试剂中的应用。3.一种诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的引物组。4.根据权利要求3所述的诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的试剂盒，其特征在于，外套上游引物和外套下游引物的摩尔比为1:1；内套上游引物和内套下游引物的摩尔比为1:1。5.根据权利要求3所述的诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照、阳性对照、2×PCRMixture。6.根据权利要求5所述的诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为无DNA酶的ddH2O；所述阳性对照为含有猪瘟病毒E2基因片段的克隆质粒pEASY-T1-CSFV671，阳性对照pEASY-T1-CSFV671质粒的终浓度范围为1.0×106copies/μl～1.0×107copies/μl；所述猪瘟病毒E2基因片段的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示。7.根据权利要求6所述的诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的试剂盒，其特征在于，所述克隆质粒采用以下方法制备得到：利用SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物序列扩增猪瘟病毒E2基因片段，回收片段与pEASY-T1载体连接，筛选阳性克隆，测序正确的克隆质粒命名为pEASY-T1-CSFV671。8.根据权利要求3-7任一项所...

【专利技术属性】
技术研发人员：喻正军，李增强，石建，廖娟红，
申请(专利权)人：湖南新南方养殖服务有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43