岩黄连叶片的石蜡切片方法技术

本发明专利技术公开了一种岩黄连叶片的石蜡切片方法，包括样品固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与展片、脱蜡、染色以及封片，所述染色包括以下步骤：在透明之前，将脱水后的岩黄连叶片放于体积浓度为0.8‑1.2％的番红溶液浸染8‑12h；在染色步骤中，将载有岩黄连叶片的玻片进行复水，复水后再放于酒精溶液中进行分色，同时向用于分色的酒精溶液中加入体积比为1/(800‑1000)的醋酸，最后放入体积浓度为0.8‑1.2％的固绿溶液中染色5‑15秒。本发明专利技术制备出来的岩黄连叶片轮廓组织清晰适用于药材的鉴别。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及组织学领域。更具体地说，本专利技术涉及一种岩黄连叶片的石蜡切片方法。
技术介绍
岩黄连(CorydalissaxicolaBunting)是罂粟科植物，为多年生草本植物，分布于我国广西、广东、福建、湖南等省。全草入药，全草含脱氢卡维丁(岩黄连碱)等活性成分，具有显著的抗菌、消炎、镇痛和强安定作用，并发现其有抑制肿瘤细胞的作用，主治疮疖肿毒、肝炎、肝硬化、肝癌等症。岩黄连是著名的壮瑶药品种，岩黄连植物分布局限于石灰岩山区，属石山特有种。由于生境条件恶劣，其自然繁殖率很低，种群发展困难，资源蕴藏量十分有限，加上其种子细小，繁殖比较困难，在引种栽培时较难成活，近年来人们大量采挖和收购，导致了野生资源的供不应求，野生岩黄连资源濒临枯竭。随着日益攀升的市场价格，混淆品层出不穷，因此急需开发出岩黄连叶片切片用以鉴别药材的真伪，供规范药材市场，鉴别真伪的岩黄连切片需要达到的效果为岩黄连叶片横切结构清晰，能明确分辨海绵组织、栅栏组织、叶脉中部、维管束的轮廓等，且需要标本可以长期保存使用，为永久性显微玻片标本。常规切片技术步骤繁杂不统一，且制备出来的岩黄连叶片轮廓组织不清晰无法适用于药材的鉴别。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是解决常规切片技术制备出来的岩黄连叶片组织不清晰不能用以鉴别药材真伪问题，并提供至少后面将说明的优点。为了实现根据本专利技术的这些目的和其它优点，提供了一种岩黄连叶片的石蜡切片方法，包括样品固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与展片、脱蜡、染色以及封片，所述染色包括以下步骤：在透明之前，将脱水后的岩黄连叶片放于体积浓度为0.8-1.2％的番红溶液浸染8-12h；在染色步骤中，将载有岩黄连叶片的玻片进行复水，复水后再放于酒精溶液中进行分色，同时向用于分色的酒精溶液中加入体积比为1/(800-1000)的醋酸，最后放入体积浓度为0.8-1.2％的固绿溶液中染色5-15秒。优选的是，所述体积浓度为0.8-1.2％的番红溶液是用2/3体积无水酒精+1/3体积TO型生物透明剂的混合液为溶剂配制而成，所述体积浓度为0.8-1.2％的固绿溶液是用体积浓度为95％的酒精溶液为溶剂配制而成。优选的是，在染色之前，将脱蜡后的载有岩黄连叶片的玻片依次放入1/2体积型生物透明剂+1/2体积无水酒精混合液、无水酒精、无水酒精、体积浓度为95％酒精、体积浓度为85％酒精、体积浓度为70％酒精中复水，每级3-5秒；再放入50％酒精中分色3-10秒；之后再依次放入体积浓度为70％酒精、体积浓度为85％酒精中进一步处理，每级3-10秒。优选的是，固绿溶液染色后将载有岩黄连叶片的玻片放于放入无水酒精中洗去染色剂，此级停留3-10秒；然后依次放入无水酒精、1/2TO型生物透明剂+1/2无水酒精混合液中，每级停留3-10秒；最后将载有岩黄连叶片的玻片放入TO型生物透明剂中停留5-10分钟，此步骤重复三次。优选的是，将经过固定的叶片依次经过体积浓度为80％酒精、体积浓度为85％酒精、体积浓度为90％酒精、体积浓度为95％酒精逐级脱水，每个浓度梯度脱水45-60分钟，再放于100％酒精中脱水两次，每次30-45分钟。优选的是，每个梯度浓度的酒精溶液在对叶片脱水过程中同时进行真空抽气10-15分钟。优选的是，在脱水之前先将叶片放于波长为5-15μm的红外光下照射45-70秒，再放于体积浓度为80％酒精、体积浓度为85％酒精、体积浓度为90％酒精、体积浓度为95％酒精逐级脱水，在每级脱水过程中均将放有叶片的酒精溶液放于波长为5-15μm的红外光下照射50-80秒，脱水完成后，将叶片依然放于波长为5-15μm的红外光下照射30-60秒，然后放入0.8-1.2％的番红溶液中浸染。优选的是，对番红溶液染色后的叶片依次用1/2体积无水酒精+1/2体积TO型生物透明剂混合液以及1/3体积无水酒精+2/3体积TO型生物透明剂混合液进行透明处理，每级透明时间均为45-60分钟；再将逐级透明处理后的叶片在纯TO型生物透明剂中浸泡2次，每次浸泡60-90分钟。优选的是，在固定步骤中，将叶片放于波长为7-15μm的红外光下照射45-75秒，再放于FAA固定液中固定，在FAA固定液中固定3小时后取出，继续放于波长为7-15μm的红外光下照射30-55秒，之后再放入FAA固定液中固定，第6小时后，取出叶片放于波长为7-15μm的红外光下照射30-45秒，最后再放入FAA固定液中固定直至结束。优选的是，将岩黄连叶片放于体积浓度为0.8-1.2％的固绿溶液中染色5-15秒后取出，用无水酒精洗去固绿溶液，然后再放于添加有磷酸和壳聚糖的固绿溶液中再次染色5-10秒，其中磷酸的浓度为0.6-0.9g/L，壳聚糖的浓度为0.1-0.3g/L，再次染色完成后取出放于加有醋酸的体积浓度为50％酒精溶液中固色，体积浓度为50％酒精中加入醋酸的体积为1/(800-1000)。本专利技术至少包括以下有益效果：(1)本专利技术公布的岩黄连叶片切片方法，岩黄连叶片横切结构清晰，可以在10至12天内切出结构清晰的岩黄连叶片结构，标本可以长期保存使用，为永久性显微玻片标本，可供岩黄连药材显微鉴别应用，供规范市场；(2)岩黄连叶片脱水后叶片几乎透明，本专利技术在透明前先用番红溶液对样品进行预染色，这样在包埋的时候包埋的位置更准确，本专利技术的番红溶液是用2/3体积无水酒精+1/3体积TO型生物透明剂的混合液为溶剂配制而成，这样既可以进行透明也可以进行染色，省时省力；(3)本专利技术在固绿染色前在50％酒精中加入醋酸进行分色醋酸的加入有利于分色，使得番红固绿染色不同部位效果更明显；(4)在分色后用体积浓度为70％酒精、体积浓度为85％酒精对样品进一步处理，可以使得岩黄连叶片中各组织更立体，在染色后效果更突出，更易于观察对比；(5)在固绿染色之后，再将片子依次放入无水酒精、1/2TO型生物透明剂+1/2无水酒精混合液中，每级停留3-10秒；最后将载有岩黄连叶片的玻片放入TO型生物透明剂中停留5-10分钟，此步骤重复三次，目的是完全除去残留在叶片和玻片上蜡；(6)由于叶片中的水、氨基酸等生命物质的吸收光谱主要集中在红外区，所以用红外线照射叶片，能促进叶片内细胞等生命物质共振效应的产生，增加酶的活性和弹性，进而使得外界溶液中的物质更容易进入到细胞中，因此，在固定阶段和脱水阶段，用红外线对样片进行处理能促进固定和脱水的效果，加快进程；(7)在固绿染色后再加入磷酸和壳聚糖进行复染，磷酸和壳聚糖共同作用能提高叶片纤维的上染率，再用醋酸进一步固色，使得叶片的各组织轮廓更清晰明显。本专利技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。附图说明图1为本专利技术的对照组的石蜡切片图；图2为本专利技术的实施例1的石蜡切片图；图3为本专利技术的实施例6的石蜡切片图。具体实施方式下面结合附图对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例1：(1)固定：新鲜岩黄连叶片采下后用自来水冲净表面浮尘，吸干叶片本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种岩黄连叶片的石蜡切片方法，包括样品固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与展片、脱蜡、染色以及封片，其特征在于，所述染色包括以下步骤：在透明之前，将脱水后的岩黄连叶片放于体积浓度为0.8‑1.2％的番红溶液浸染8‑12h；在染色步骤中，将载有岩黄连叶片的玻片进行复水，复水后再放于酒精溶液中进行分色，同时向用于分色的酒精溶液中加入体积比为1/(800‑1000)的醋酸，最后放入体积浓度为0.8‑1.2％的固绿溶液中染色5‑15秒。

【技术特征摘要】
1.一种岩黄连叶片的石蜡切片方法，包括样品固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与展片、脱蜡、染色以及封片，其特征在于，所述染色包括以下步骤：在透明之前，将脱水后的岩黄连叶片放于体积浓度为0.8-1.2％的番红溶液浸染8-12h；在染色步骤中，将载有岩黄连叶片的玻片进行复水，复水后再放于酒精溶液中进行分色，同时向用于分色的酒精溶液中加入体积比为1/(800-1000)的醋酸，最后放入体积浓度为0.8-1.2％的固绿溶液中染色5-15秒。2.如权利要求1所述的岩黄连叶片的石蜡切片方法，其特征在于，所述体积浓度为0.8-1.2％的番红溶液是用2/3体积无水酒精+1/3体积TO型生物透明剂的混合液为溶剂配制而成，所述体积浓度为0.8-1.2％的固绿溶液是用体积浓度为95％的酒精溶液为溶剂配制而成。3.如权利要求1所述的岩黄连叶片的石蜡切片方法，其特征在于，在染色之前，将脱蜡后的载有岩黄连叶片的玻片依次放入1/2体积型生物透明剂+1/2体积无水酒精混合液、无水酒精、无水酒精、体积浓度为95％酒精、体积浓度为85％酒精、体积浓度为70％酒精中复水，每级3-5秒；再放入50％酒精中分色3-10秒；之后再依次放入体积浓度为70％酒精、体积浓度为85％酒精中进一步处理，每级3-10秒。4.如权利要求1所述的岩黄连叶片的石蜡切片方法，其特征在于，固绿溶液染色后将载有岩黄连叶片的玻片放于放入无水酒精中洗去染色剂，此级停留3-10秒；然后依次放入无水酒精、1/2TO型生物透明剂+1/2无水酒精混合液中，每级停留3-10秒；最后将载有岩黄连叶片的玻片放入TO型生物透明剂中停留5-10分钟，此步骤重复三次。5.如权利要求1所述的岩黄连叶片的石蜡切片方法，其特征在于，将经过固定的叶片依次经过体积浓度为80％酒精、体积浓度为85％酒精、体积浓度为90％酒精、体积浓度为95％酒精逐级脱水，每个浓度梯度脱水45-60分钟，再放于100％酒精中脱水两次，每次30-45分钟。6.如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：李翠，张占江，郭晓云，赵以民，陈晓英，胡营，
申请(专利权)人：广西壮族自治区药用植物园，
类型：发明
国别省市：广西;45