一种高效水解大豆异黄酮苷的方法技术

本发明专利技术涉及一种高效水解大豆异黄酮苷的方法，具体是使用基因工程方法将纤维素结合域基因与β‑葡糖苷酶基因在毕赤酵母中进行融合表达。获得的融合蛋白的纤维素结合域与纤维素通过疏水作用结合而实现葡糖苷酶的固定化。与其他的固定化方法相比，本发明专利技术所用方法无需对酶进行预先纯化，也无需其他试剂协助固定化，大大降低了固定化所需的时间和材料成本，并且易于酶的回收利用，有利于工业化大规模利用。而固定化的β‑葡糖苷酶具有很好的热稳定性及很好的大豆异黄酮苷水解能力。

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术涉及生物
，更具体地涉及蛋白质的重组表达，高效固定化和大豆异黄酮苷的高效水解等领域，具体涉及一种能够高效快速固定化β-葡糖苷酶的方法，以及能够利用循环使用固定化酶进行高效大豆异黄酮苷的水解，还建立了连续水解大豆异黄酮苷的方法。
技术介绍
大豆异黄酮为雌性激素类似物，具有类雌性激素样作用，是大豆中的活性成分。大豆异黄酮类物质是由一位美国学者在1986年制作大豆胚芽制品中发现的。在1990年，美国的国家癌症研究所(AmericanCancerInstitute，ACI)根据大豆异黄酮的功能作用，邀请了有关专家对其抗癌效果进行研讨，证明大豆异黄酮是较好的抗癌防癌物质，并将大豆列为精深加工和医药产品的重点开发项目。但是从大豆中提取的天然大豆异黄酮主要以糖苷形式存在，大量研究表明植物中的大豆异黄酮类物质的苷元形式才能更好的被吸收，而且其苷元形式如黄豆苷元、染料木素的生物活性更好(Ruferetal.2008，Iovineetal.2012)。大豆异黄酮苷为酚羟基与糖缩合形成的β-D葡糖苷类物质。通过水解的方法可以使其糖苷键断裂而得到糖基和高活性的大豆异黄酮苷元。其水解方法主要有(Cowardetal.1993，Utkinaetal.2004，Yuanetal.2008)：(1)酸水解法：在烯醇中使用稀酸如盐酸、稀硫酸等可将糖苷键水解得到异黄酮苷元。(2)碱水解法：异黄酮糖苷键具有酯苷键性质，可用碱将其水解。(3)Smith降解法：首先利用NaIO4将糖的二羟基氧化断裂为醛基，然后利用NaBH4将其还原为二元醇最后与稀酸作用而水解以达到水解目的。(4)酶解法：大豆异黄酮苷的糖苷键为β-D葡萄糖苷键，可利用β-D葡糖苷酶将其水解。酶解法的反应条件温和，专一性强，只对目的糖苷键进行水解，使得苷元的结构不被破坏。目前已经有一些酶解法水解大豆异黄酮类物质的研究，其中，XiaoqingYang等利用Paecilomycesthermophila中的β-D-葡糖苷酶在4小时内、50℃下可将大豆或大豆胚芽提取物中的异黄酮水解93％(Yangetal.2009)。Otieno等对比杏仁中提取的外源性β-D-葡糖苷酶和双歧杆菌及乳酸菌中β-D-葡糖苷酶对豆奶中大豆异黄酮苷的转化作用，发现外源性的β-D-葡糖苷酶水解效果更好(OtienoandShah2007)。但是，由于商业化的β-D-葡糖苷酶价格昂贵，且不易回收利用，使得直接用β-D-葡糖苷酶水解大豆异黄酮苷的成本较高，使其在应用时受到限制。目前也有一些固定化葡糖苷酶技术水解大豆异黄酮苷的研究，如JieChang等人利用chitsoan-carbon作为固定化载体在水相-有机相两相系统中水解大豆异黄酮苷(Changetal.2013)。但是在经过15次重复利用后其活性只有50％，而且其固定化载体价格昂贵、固定化过程较为繁琐，不利于工业上的大规模使用。纤维素非常适合作为大规模亲和层析的树脂填料，具有以下优点：价格便宜；具有很好的物理特性；对于不含纤维素结合域的蛋白吸附能力弱；不与常见的缓冲液反应；无生物安全问题。能够与纤维素结合的亲和标记是纤维素结合域(CBM)。其与纤维素的结合能力强，能够耐受酶的水解和产品纯化过程中的酸碱；非特异性吸附低；促进蛋白质折叠(Wanetal.2011)。
技术实现思路
本专利技术通过将纤维素结合域基因与β-葡糖苷酶基因在毕赤酵母中进行融合表达获得重组蛋白；重组蛋白可以与磷酸溶胀纤维素通过疏水作用结合实现酶的固定化；固定化的重组酶可以水解大豆异黄酮类物质使其成为苷元的形式；固定化葡糖苷酶在水解后可通过离心直接回收以实现酶的循环使用。本专利技术的第一个方面涉及一种融合蛋白，所述融合蛋白包含融合表达的纤维素结合域(以下也称为CBM3)和β-葡糖苷酶(以下也称为BGL1)。在优选的实施方案中，所述纤维素结合域和β-葡糖苷酶分别由纤维素结合域基因(cbm3)与β-葡糖苷酶基因(bgl1)编码。本专利技术的第二个方面涉及一种构建体，所述构建体用于编码上述的融合蛋白，所述构建体包含彼此连接的纤维素结合域基因(cbm3)与β-葡糖苷酶基因(bgl1)。在优选的实施方案中，所述纤维素结合域基因的GenBank登陆号为EEU00265。在优选的实施方案中，所述β-葡糖苷酶基因的GenBank登陆号为DQ114397.1。本专利技术的第三个方面涉及一种重组载体，所述载体包含本专利技术第二个方面所述的构建体。在优选的实施方案中，所述载体由出发质粒pPICZαA改造获得。本专利技术的第四个方面涉及一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本专利技术第二个方面所述的构建体或本专利技术第三个方面所述的重组载体。在优选的实施方案中，所述宿主细胞是毕赤酵母。在优选的实施方案中，所述宿主细胞是毕赤酵母KM71H。本专利技术的第五个方面涉及一种固定化的β-葡糖苷酶，所述固定化的β-葡糖苷酶包含本专利技术第一个方面的融合蛋白以及与所述融合蛋白结合的纤维素。在优选的实施方案中，所述纤维素为磷酸溶胀纤维素。在优选的实施方案中，所述纤维素为磷酸溶胀无定形纤维素。在优选的实施方案中，所述结合通过疏水相互作用结合。本专利技术的第六个方面涉及一种固定化β-葡糖苷酶的方法，所述方法包括以下步骤：1)将β-葡糖苷酶与纤维素结合域融合表达；2)将得到的如本专利技术第一个方面所述的融合蛋白与纤维素接触。在优选的实施方案中，所述纤维素为磷酸溶胀纤维素。在优选的实施方案中，所述纤维素为磷酸溶胀无定形纤维素。本专利技术的第七个方面涉及一种水解β-葡糖苷酶底物的方法，所述方法包括将本专利技术第五方面所述的固定化的β-葡糖苷酶与所述β-葡糖苷酶底物接触。在优选的实施方案中，所述方法包括以下步骤：1)利用蠕动泵将β-葡糖苷酶底物连续泵入装有固定化的β-葡糖苷酶的水解反应装置，同时保持所述水解反应装置温度恒定；2)经β-葡糖苷酶酶解后得到的产物流入收集器。在优选的实施方案中，所述β-葡糖苷酶底物是大豆异黄酮苷。在优选的实施方案中，所述大豆异黄酮苷选自染料木苷、黄豆苷、黄豆黄苷或其组合。本专利技术的第八个方面涉及一种连续水解装置，所述装置包括依次连接的底物储存器、蠕动泵、水解反应装置和水解产物收集器，所述水解反应装置温度恒定。在优选的实施方案中，所述水解反应装置通过置于恒温水浴槽中保持温度恒定。在优选的实施方案中，所述水解反应装置通过水循环装置保持温度恒定。在优选的实施方案中，所述底物是大豆异黄酮苷，优选选自染料木苷、黄豆苷、黄豆黄苷或其组合，相应地，所述水解反应装置内装有固定化酶，优选如上文所述的固定化的β-葡糖苷酶。在优选的实施方案中，所述融合蛋白的构建过程如下：1)纤维素结合域基因(cbm3)与β-葡糖苷酶基因(bgl1)的融合，插入到质粒pPICZαA的构建表达载体。获得CBM3基因(cbm3，GenBank：HQ232851)和BGL1基因，酶切后使用T4连接酶进行连接构建融合表达载体。2)将第一项中构建的表达载体pPICZαA-CBM3-BGL1使用SacI酶切进行线性化后通过电穿孔转化进入表达菌株毕赤酵母KM71H中并通过甲醇诱导表达。在优选的实施方案中，所述β-葡糖苷酶的固定化过程如下：采用磷酸溶胀无定形纤维素与融合蛋白的表达上清在25℃混合30分钟，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种融合蛋白，所述融合蛋白包含融合表达的纤维素结合域和β‑葡糖苷酶，优选所述纤维素结合域和β‑葡糖苷酶分别由纤维素结合域基因和β‑葡糖苷酶基因编码，其中优选所述纤维素结合域基因的GenBank登录号为EEU00265，所述β‑葡糖苷酶基因的GenBank登录号为DQ114397.1。

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含融合表达的纤维素结合域和β-葡糖苷酶，优选所述纤维素结合域和β-葡糖苷酶分别由纤维素结合域基因和β-葡糖苷酶基因编码，其中优选所述纤维素结合域基因的GenBank登录号为EEU00265，所述β-葡糖苷酶基因的GenBank登录号为DQ114397.1。2.一种构建体，所述构建体包含彼此连接的纤维素结合域基因与β-葡糖苷酶基因，其中优选所述纤维素结合域基因的GenBank登录号为EEU00265，所述β-葡糖苷酶基因的GenBank登录号为DQ114397.1。3.一种重组载体，所述载体包含根据权利要求2所述的构建体。4.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求2所述的构建体或权利要求3所述的重组载体，所述宿主细胞优选是毕赤酵母。5.一种固定化的β-葡糖苷酶，所述固定化的β-葡糖苷酶包含根据权利要求1的融合蛋白以及与所述融合蛋白结合的纤维素，其中所述纤维素优选为磷酸溶胀纤维素，更优选为磷酸溶胀无定形纤维素。6.一种固定化β-葡糖苷酶的方法，所述方法包括以下步骤：1)将β-...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪泂，胡圣霖，王冬梅，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34