一种鲟源嗜水气单胞菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种鲟源嗜水气单胞菌及其应用，所述的鲟源嗜水气单胞菌保藏编号为CCTCC NO:M 2016555。利用上述的鲟源嗜水气单胞菌用于制备的灭活疫苗，可以预防鲟鱼细菌性败血症的发生。灭活疫苗中嗜水气单胞菌HZ8（Aeromonas HydrophilaHZ8）的数量不低于1.0×108 CFU/ml。本发明专利技术筛选得到的鲟源嗜水气单胞菌具有高致病性，用其制备的灭活疫苗，能够预防鲟鱼细菌性败血症的发生，具有良好的市场推广前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于兽用生物制品
，具体是涉及一种鲟源嗜水气单胞菌及其应用。
技术介绍
鲟鱼是我国重要的淡水养殖品种之一，在我国淡水养殖业中具有重要地位。我国鲟鱼养殖主要集中在山东、湖北、云南、四川、浙江、湖南、河北、广东、贵州、福建、北京等省(直辖市)。据统计，2014年全国鲟鱼总产量为7.6万吨，比2013年产量增长17.43％，在淡水养殖主要鱼类中产量增值幅度排名第三。施氏鲟(Amursturgeon,AcipenserschrenckiiBrandt,1869)是我国北方鲟鱼养殖的主要品种，且有较大的野生产量。随着施氏鲟养殖规模的不断扩大，集约化程度的不断提高以及养殖水环境的恶化，施氏鲟病害尤其是细菌性疾病的问题日益突出，给养殖业造成重大经济损失，目前已成为威胁我国施氏鲟养殖业健康发展的主要因素。嗜水气单胞菌(AeromonasHydrophila)隶属于单胞菌科(Aermonadaceae)气单胞菌属(Aeromonas)，广泛分布于淡水、污水及土壤中，能引起多种水产养殖动物患病。鲟鱼感染嗜水气单胞菌后，引起鲟鱼细菌性败血症，主要症状表现为腹部、口腔周围、骨板基部出血，肛门红肿，鳃丝颜色较淡；剖检有淡红色腹水，肌肉、肾脏、性腺充血，后肠出血发炎，并充满泡沫状粘液物质，可引起鲟鱼大规模死亡。长期以来，主要依赖抗生素对鲟鱼细菌性败血症进行治疗，但是随着病原菌耐药性产生，水产品质量安全问题日渐显现，寻求新的防治方法已成为科研工作关注的热点。目前，开展免疫预防是控制鱼类嗜水气单胞菌感染暴发的重要手段，国内外学者已在其疫苗研发方面做了大量的工作，但因嗜水气单胞菌血清型多，对异种血清型菌株的免疫预防效果都不太理想，难以大范围推广使用，嗜水气单胞菌的抗原多样性已成为开发有效疫苗的主要障碍。因此，防止鲟鱼感染嗜水气单胞菌，选择来源于鲟鱼的嗜水气单胞菌是研制高效疫苗及筛选疫苗生产菌株的关键。已知嗜水气单胞菌不同菌株间存在着毒力差异，致病力的有无及强弱取决于毒力因子的种类组成。因此，筛选出致病力强、免疫原性好的鲟源嗜水气单胞菌对于制备疫苗具有重要的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了一种鲟源嗜水气单胞菌HZ8，所述的鲟源嗜水气单胞菌HZ8已于2016年10月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNO：M2016555，分类命名：嗜水气单胞菌(AeromonasHydrophila)HZ8，地址：中国武汉武汉大学。本专利技术的另一个目的在于提供了一种嗜水气单胞菌HZ8在制备鲟鱼细菌性败血症疫苗中的应用，该菌株为鲟鱼细菌性败血症的预防提供了产品和方法。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：一种嗜水气单胞菌HZ8：本专利技术所述的鲟源嗜水气单胞菌HZ8为申请人自鲟鱼中分离获得，该菌株在Arg，Leu，Asp和Met4种氨基酸为碳源的合成培养基生长良好，最适生长条件为pH7.0，28℃以及液体培养基中溶解氧7.5～10g/L。在合成培养基础上，氨基酸Ser，Val，Trp，Aaf和Phe有较强的促进嗜水气单胞菌生长的能力。锌离子抑制细菌的生长；低浓度的铁离子对细菌生长有一定的促进作用。该菌株含有气溶素(aer)、鞭毛基因(fla)、热稳定性细胞兴奋性肠毒素(ast)、热不稳定性细胞兴奋性肠毒素(alt)、溶血素(hly)、弹性蛋白酶(ahyB)，横项鞭毛蛋白(laf)、肠毒素蛋白(act)和脂酶(lip)。该菌株对头孢他啶、头孢呋辛、头孢哌酮钠、头孢噻肟、头孢曲松钠、氨曲南和头孢吡肟抗生素敏感。所述的嗜水气单胞菌HZ8已于2016年10月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNO：M2016555，分类命名：嗜水气单胞菌(AeromonasHydrophila)HZ8，地址：中国武汉武汉大学。一种嗜水气单胞菌HZ8在制备鲟鱼细菌性败血症疫苗中的应用，包括利用该菌株作为主效成分，或是主效成分之一制备成鲟鱼细菌性败血症疫苗；所述的疫苗包括目前存在的灭活疫苗，减毒疫苗等目前已知的疫苗。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：本专利技术首次筛选得到的鲟源的具有高致病性的嗜水气单胞菌，该菌株共有9个毒力因子，包括气溶素(aer)、鞭毛基因(fla)、热稳定性细胞兴奋性肠毒素(ast)、热不稳定性细胞兴奋性肠毒素(alt)、溶血素(hly)、弹性蛋白酶(ahyB)，横项鞭毛蛋白(laf)、肠毒素蛋白(act)和脂酶(lip)。利用该菌株制备的灭活疫苗，能够预防鲟鱼细菌性败血症的发生，本专利技术解决了目前市场上无高致病性的鲟源嗜水气单胞菌疫苗，以及异种血清型嗜水气单胞菌疫苗用于鲟鱼效果不理想的问题，具有良好的市场推广前景。附图说明图1为鲟源嗜水气单胞菌HZ8—革兰氏阴性菌示意图；标尺：5微米。图2为嗜水气单胞菌HZ8磷钨酸负染结果(×2000倍)图3为8株菌株系统发育树。图4为8株嗜水气单胞菌ERIC扩增结果示意图。其中：泳道M：5kbDNAladderMarker；1：YW2；2：TR3；3：TH5；4：HZ8；5：ZG9；6：ZJ10；7：QJ11；8：ZJ12；9：阴性对照。图5为注射灭活疫苗和PBS后试验鱼外周血红细胞数量变化示意图。图6为注射灭活疫苗和PBS后试验鱼外周血白细胞数量变化示意图。图7为注射灭活疫苗和PBS后试验鱼外周血单核细胞分类百分比变化示意图。图8为注射灭活疫苗和PBS后试验鱼外周血嗜中性粒细胞分类百分比的变化示意图。图9为注射灭活疫苗和PBS后试验鱼外周血淋巴细胞分类百分比的变化示意图。图10为注射灭活疫苗和PBS后试验鱼外周血细胞吞噬指数的变化示意图。图11为注射灭活疫苗和PBS后试验鱼外周血细胞吞噬百分率变化示意图。图12为注射灭活疫苗和PBS后试验鱼血清中酸性磷酸酶活性变化示意图。图13为注射灭活疫苗和PBS后试验鱼血清中溶菌酶活性变化示意图。图14为试验鱼的血清抗体效价随时间的变化曲线。具体实施方式本专利技术所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料如未特别说明，均来源于商业渠道；本专利技术所述试验鱼为施氏鲟(Amursturgeon，AcipenserschrenckiiBrandt，1869)实施例1：嗜水气单胞菌HZ8的分离及鉴定：本专利技术采用分子生物学方法，对8株鲟源嗜水气单胞菌病原菌开展了以致病性、表型分析、分子鉴定及毒力基因检测为内容的实验研究。基于所有菌株gyrB基因序列构建了系统发育树，8个菌株都与嗜水气单胞菌聚为一支；用PCR方法检测了9个毒力基因在菌株中的分布模式。仅HZ8菌株含有所有检测毒力基因：气溶素(aer)、鞭毛基因(fla)、热稳定性细胞兴奋性肠毒素(ast)、热不稳定性细胞兴奋性肠毒素(alt)、溶血素(hly)、弹性蛋白酶(ahyB)，横项鞭毛蛋白(laf)、肠毒素蛋白(act)和脂酶(lip)。此外,以施氏鲟为感染对象,HZ8菌株半数致死剂量最低，毒力最强，为2.28×104cfu/ml。具体步骤如下：(1)将从湖北、广州、浙江、江苏等地收集的病症典型的鲟鱼，无菌条件下从肝脏分离细菌，画线接种于LB固体培养基平皿上，37℃培养24h，挑取形态一致的优势菌落进行纯化培养，获得8株分离菌，分别命名为YW2、TR3、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鲟源嗜水气单胞菌，所述的嗜水气单胞菌为嗜水气单胞菌（Aeromonas Hydrophila）HZ8，其保藏编号为CCTCC NO：M 2016555。

【技术特征摘要】
1.一种鲟源嗜水气单胞菌，所述的嗜水气单胞菌为嗜水气单胞菌（AeromonasHydrophila）HZ8，其保藏编号为CCTCCNO：M2016555。2....

【专利技术属性】
技术研发人员：周勇，曾令兵，范玉顶，史玉恒，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院长江水产研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42