本发明专利技术公开了一种大蒜根尖分生组织再生的方法及应用。主要采用宝坻大蒜根作为外植体诱导愈伤组织，诱导培养基为：MS+1mg·L‑12,4‑D+1mg·L‑16‑BA+30.0g·L‑1蔗糖+7.5g·L‑1琼脂，pH=5.8，愈伤组织诱导率达97.5%。愈伤组织经过继代两次后进行再分化，在分化7周后，不定芽长到5cm时进行试管鳞茎的诱导，试管鳞茎诱导培养基为：MS+120g·L‑1绵白糖+6.8g·L‑1琼脂，pH=7.5。该方法为大蒜愈伤组织途径进行脱毒快繁提供了新的技术方法，通过试管鳞茎途径再生提高了组培苗的成活率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术得到天津市农委重点资助项目（201302030）；天津师范大学应用开发研究基金重点项目资助（52XK1210，52XK1505）。
本专利技术属于农业生物工程
，涉及大蒜组织培养与快繁的方法，更具体的说是构建一种大蒜根尖分生组织再生的方法。
技术介绍
大蒜作为无性繁殖作物，生产上多以大蒜瓣为种子进行种植，生产成本高、繁殖系数低、病毒积累、种性退化等问题严重影响大蒜生产。寻找大蒜快繁、脱毒以及种质遗传改良技术迫在眉睫。前人工作中构建了多种大蒜快繁脱毒技术体系，如用大蒜幼叶、全展叶根尖、茎尖、花序轴等为外植体构建大蒜组织培养体系；张素芝等利用大蒜茎盘进行愈伤组织的诱导，并获得了适宜于愈伤组织增殖分化的培养基；Luciani等以大蒜茎尖为外植体诱导出再生能力较强的愈伤组织；张昌伟等则通过大蒜根尖直接诱导不定芽，得到试管苗并成功的得到了试管鳞茎。大蒜根尖分生组织处于生长顶端，分生组织细胞分裂快，带毒量少甚至不带毒，且一颗蒜瓣可以发几条甚至几十条根，实验取材方便，较大蒜茎尖比较，每一颗蒜瓣只有一个茎尖，用于愈伤组织诱导的茎尖需要在解剖镜下剥离，后期的消毒程度对愈伤组织诱导也有一定的影响。本专利技术采用大蒜蒜瓣整体消毒后，无菌条件下发根，以根尖分生组织为外植体，通过高频诱导愈伤组织、诱导再生不定芽和试管鳞茎，构建再生技术体系，所得试管鳞茎均具有储藏叶，可直接种于大田，易于管理，能明显提高试管苗的移栽成活率。
技术实现思路
本专利技术的目的在于公开了一种大蒜根尖分生组织再生的方法，其特征在于按如下的步骤进行：（1）以大蒜根尖分生组织为外植体诱导愈伤组织：选取没有病斑的大蒜鳞茎剥去外皮后自来水冲洗30min，然后于紫外灭菌后的超净工作台中用0.1%（w/w）的HgCl2浸泡20min，无菌蒸馏水洗涤2-3次，75%（w/w）的酒精浸泡10min，无菌蒸馏水洗涤3-5遍后，将大蒜鳞茎接入无菌培养瓶中生根；待根长至2-3cm时，切下大蒜根部，用解剖针纵划，将其接入筛选培养基中进行愈伤组织诱导；诱导培养基为MS+1mg·L-12,4-D+1mg·L-16-BA+30.0g·L-1蔗糖+7.5g·L-1琼脂，pH=5.8；愈伤组织诱导率达97.5%；（2）大蒜根尖愈伤组织继代和再分化：大蒜根尖愈伤组织在诱导培养基上生长4周后，可进行继代，继代培养约2周时，愈伤组织颗粒感明显，呈浅黄色，继代培养4周时，愈伤组织增值明显，继代两次后进行再分化，继代培养基与诱导培养基相同，再分化培养基为：MS+3mg·L-16-BA+30g·L-1蔗糖+7.5g·L-1琼脂，pH=5.8；（3）试管鳞茎诱导与收获再分化培养1周时愈伤组织表面开始出现大量的绿点，2周可以观察到绿点不断生长，逐渐形成不定芽，3周时，大部分绿点形成不定芽，4周不定芽长至约2cm，7周后不定芽生长长至5-8cm的簇生试管苗，将簇生试管苗移入诱导试管鳞茎培养基，其培养基为MS+120g·L-1绵白糖+6.8g·L-1琼脂，pH=7.5，试管鳞茎成熟后取出，清洗表层培养基后阴干，放4℃冰箱低温储存。本专利技术进一步公开了大蒜根尖分生组织再生的方法在提高组培苗成活率方面的应用。实验结果证明：用大蒜无菌根为外植体诱导愈伤组织，诱导率达97.5%；愈伤组织再生率可达85%，试管鳞茎的诱导率达95%以上。通过组培途径诱导发育的试管鳞茎对环境适应性强，耐贮藏，易成活。本专利技术通过大蒜根尖分生组织诱导的愈伤组织，诱导再生植株进而获得试管鳞茎，这些试管鳞茎均具有储藏叶，即均具有发芽的潜力。为大蒜组织培养途径脱毒快繁提供了新的技术方法。本专利技术以大蒜根尖分生组织为外植体诱导愈伤组织，愈伤组织经过继代培养，诱导再生试管苗，试管苗直接诱导成具有萌发能力的试管鳞茎，避免了试管苗经过生根、炼苗、移栽等繁琐过程，提高了试管苗成活率。同时与通过茎尖组培途径相比，虽然根尖和茎尖都处于生长点，都有天然脱毒的效果，但每一个大蒜瓣只有一个茎尖，用于愈伤组织诱导的茎尖需要在解剖镜下剥离，后期的消毒程度对愈伤组织诱导也有一定的影响；而一个大蒜瓣可以发出几条或几十条根，大蒜瓣可以整体消毒后再进行根的诱导萌发，实验取材方便，材料量充足。本专利技术更加详细的描述如下：（1）大蒜根尖分生组织获得：选取没有病斑的大蒜鳞茎剥去外皮后自来水冲洗30min，然后于紫外灭菌后的超净工作台中用0.1%（w/w）的HgCl2浸泡20min，无菌蒸馏水洗涤2-3次，75%（w/w）的酒精浸泡10min，无菌蒸馏水洗涤3-5遍后，将大蒜鳞茎接入无菌培养瓶中生根；（2）以大蒜根尖分生组织为外植体诱导愈伤组织：待（1）中培养的无菌根长至2-3cm时，切下大蒜根部，用于愈伤组织诱导。诱导培养基为MS+1mg·L-12,4-D+1mg·L-16-BA+30.0g·L-1蔗糖+7.5g·L-1琼脂，pH=5.8，诱导率达97.5%。其具体的方法如下：将切下大蒜根用无菌解剖针纵向划开制造伤口，接入愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织诱导。经过1周左右，大蒜根尖分生组织区出现膨大现象并变为浅褐色；大约2周后；大蒜根尖分生组织区持续膨大并变为浅黄色；3周后大蒜根尖分生组织区出现明显的组织结构，呈浅黄色半透明状态；大约4周后，大蒜根尖分生区有明显的块状愈伤组织生成。（3）大蒜根尖愈伤组织继代和再分化：大蒜根尖愈伤组织在诱导培养基上生长4周后，可进行继代。具体方法为：继代培养约2周时，愈伤组织颗粒感明显，呈浅黄色。继代培养约4周时，愈伤组织增值明显。继代两次后进行再分化。继代培养基与诱导培养基相同，再分化培养基为：MS+3mg·L-16-BA+30g·L-1蔗糖+7.5g·L-1琼脂，pH=5.8。（4）试管鳞茎诱导与收获：再分化培养1周左右时愈伤组织表面开始出现大量的绿点，约2周左右可以观察到绿点不断生长，逐渐形成不定芽，3周左右时，大部分绿点形成不定芽，4周左右不定芽长至约2cm，7周后不定芽长至5-8cm的簇生试管苗，将簇生试管苗移入诱导试管鳞茎培养基，其培养基为MS+120g·L-1绵白糖+6.8g·L-1琼脂，pH=7.5，试管鳞茎成熟后取出，清洗表层培养基后阴干，放4℃冰箱低温储存。本专利技术所述的NAA是a-萘乙酸（1-naphthlceticacid），简称NAA；KT是激动素（Kinetin）,简称KT；所述的MS基本培养基配方：每1L基本培养基中含有：KNO31900mg,NH4NO31650mg,MgSO4∙7H2O370mg,KH2PO4170mg,CaCl2∙2H2O440mg,MnSO4∙4H2O22.3mg,ZnSO4∙7H2O8.6mg,H3BO36.2mg,KI0.83mg,Na2MO3∙2H2O0.25mg,CuSO4∙5H2O0.025mg,CoCl2∙6H2O0.025mg,Na2-EDTA37.7mg,FeSO4∙7H2O27.8mg,甘氨酸2.0mg,盐酸硫胺素0.4mg,盐酸吡哆素0.5mg,烟酸0.5mg,肌醇100mg。下面本专利技术以典型的天津市宝坻大蒜快繁为代表，更加具体的说明实施方案：（1）大蒜根尖分生组织获得：选取没有病斑的宝坻大蒜“六瓣红”鳞茎，剥去外皮后自来水冲洗30min，然后于紫外灭菌后的超净工作台中本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种大蒜根尖分生组织再生的方法，其特征在于按如下的步骤进行：（1）以大蒜根尖分生组织为外植体诱导愈伤组织：选取没有病斑的大蒜鳞茎剥去外皮后自来水冲洗30 min，然后于紫外灭菌后的超净工作台中用0.1%（w/w）的 HgCl2浸泡20 min，无菌蒸馏水洗涤2‑3次，75%（w/w）的酒精浸泡10 min，无菌蒸馏水洗涤3‑5遍后，将大蒜鳞茎接入无菌培养瓶中生根；待根长至2‑3cm时，切下大蒜根部，用解剖针纵划，将其接入筛选培养基中进行愈伤组织诱导；诱导培养基为MS+1 mg·L‑1 2,4‑D+ 1 mg·L‑1 6‑BA+30.0 g· L‑1 蔗糖+7.5 g ·L‑1 琼脂，pH=5.8；（2）大蒜根尖愈伤组织继代和再分化：大蒜根尖愈伤组织在诱导培养基上生长4周后，可进行继代，继代培养约2周时，愈伤组织颗粒感明显，呈浅黄色，继代培养4周时，愈伤组织增值明显，继代两次后进行再分化，继代培养基与诱导培养基相同，再分化培养基为：MS+3 mg·L‑16‑BA+30g·L‑1蔗糖+7.5g·L‑1琼脂，pH=5.8；（3）试管鳞茎诱导与收获再分化培养1周时愈伤组织表面开始出现大量的绿点，2周可以观察到绿点不断生长，逐渐形成不定芽，3周时，大部分绿点形成不定芽，4周不定芽长至约2cm，7周后不定芽生长长至5‑8 cm的簇生试管苗，将簇生试管苗移入诱导试管鳞茎培养基，其培养基为MS + 120 g · L‑1 绵白糖 + 6.8 g · L‑1琼脂， pH=7.5，试管鳞茎成熟后取出，清洗表层培养基后阴干，放4 ℃冰箱低温储存。...
【技术特征摘要】
1.一种大蒜根尖分生组织再生的方法，其特征在于按如下的步骤进行：（1）以大蒜根尖分生组织为外植体诱导愈伤组织：选取没有病斑的大蒜鳞茎剥去外皮后自来水冲洗30min，然后于紫外灭菌后的超净工作台中用0.1%（w/w）的HgCl2浸泡20min，无菌蒸馏水洗涤2-3次，75%（w/w）的酒精浸泡10min，无菌蒸馏水洗涤3-5遍后，将大蒜鳞茎接入无菌培养瓶中生根；待根长至2-3cm时，切下大蒜根部，用解剖针纵划，将其接入筛选培养基中进行愈伤组织诱导；诱导培养基为MS+1mg·L-12,4-D+1mg·L-16-BA+30.0g·L-1蔗糖+7.5g·L-1琼脂，pH=5.8；（2）大蒜根尖愈伤组织继代和再分化：大蒜根尖愈伤组织在诱导培养基上生长4周后，可进行继代，继代培养约2...
【专利技术属性】
技术研发人员：王振英，尚云涛，范宝莉，徐李薇，刘晓颖，党光，陈宏，兰桂霞，
申请(专利权)人：天津师范大学，
类型：发明
国别省市：天津;12
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。