一种白簕多糖的分离纯化方法技术

本发明专利技术属于分离纯化技术领域，尤其涉及一种白簕多糖的分离纯化方法。本发明专利技术中白簕茎经热水浸提，对过滤后的浸提液进行醇沉淀，依次用无水乙醇、乙醚、丙酮洗涤所述醇沉淀，喷雾干燥后即得白簕粗多糖；白簕粗多糖经DEAE‑cellulose 52离子柱、Sephadex G‑50层析柱柱层析分离、纯化，首次得到中性均一多糖ATP1‑1和酸性多糖组分ATP2、ATP3。本发明专利技术可使白簕多糖的脱蛋白率达78.21％，多糖保留率达84.57％，相比于传统方法提取粗多糖所含有的大量核酸、蛋白质及肽类等杂质，本方法显著提高了产品纯度，为将来在食品、保健品、医药等领域应用奠定了坚实的基础；同时本发明专利技术操作简便、高效，适用于大规模工业生产，获得多糖性质专一，生理活性高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分离纯化
，尤其涉及一种白簕多糖的分离纯化方法。
技术介绍
白簕Acanthopanaxtrifoliatus(L.)Merr.，又名：鹅掌簕、三叶五加、三加皮等，为五加科(Araliaceae)攀援状灌木。是我国华南、西南、华中等地区常用的民间草药。本品味苦、辛，性凉，根、茎、叶均可入药，具有清热解毒、祛风除湿、舒筋活血、消肿止痛、止咳平喘等功效。其嫩叶富含Vc、叶绿素、粗蛋白、可溶性糖、氨基酸和人体必需的矿质元素，是一种营养和保健价值都很高的野生蔬菜，具有较高的经济价值和广泛的开发前景。研究发现，白簕茎中多糖含量较其他药用部位更高，鉴于五加科植物多糖具有免疫调节、抗肿瘤、造血调控、抗炎、抗缺氧、抗衰老、抗疲劳、中枢抑制等广泛的生理活性和毒副作用低的特点，国内外学者对五加科植物多糖的研究方兴未艾。目前关于白簕多糖提取工艺的研究比较粗浅，仅限于通过传统方法提取粗多糖，且含有大量核酸、蛋白质及肽类等杂质，产品纯度低，系属多种组分的混合物。目前还未提供一种分离出白簕多糖中各多糖组分的方法，对白簕多糖各组分进一步的结构研究也几乎空白。本专利技术通过对白簕多糖(Acanthopanaxtrifoliatuspolysaccharides,ATP)的提取、分离和纯化，得到一个中性均一多糖ATP1-1和两个酸性多糖组分ATP2、ATP3，并且对其中ATP1-1多糖的理化性质、分子量、单糖组成等进行了系统的分析鉴定，为将来在食品、保健品、医药等领域应用奠定了坚实的基础。
技术实现思路
本专利技术为了解决现有白簕多糖分离纯化方法的不足，提供了一种白簕多糖的分离纯化方法，即白簕茎经热水浸提，对过滤后的浸提液进行醇沉淀，依次用无水乙醇、乙醚、丙酮洗涤所述醇沉淀，喷雾干燥后即得白簕粗多糖；白簕粗多糖经Sevage法脱蛋白后经过DEAE-cellulose柱层析，分离得到中性多糖ATP1和酸性多糖ATP2、ATP3，中性多糖ATP1经Sephadex柱层析分离提纯后得到中性均一的多糖ATP1-1。进一步，所述白簕多糖的分离纯化方法，包括如下步骤：1)白簕粗多糖的提取：①取干燥的白簕茎粉碎、过20目筛，加入蒸馏水后，于90～100℃浸提两次，每次0.5～4h；②合并浸提液，减压浓缩后，离心并弃去沉淀，向上清液中加入无水乙醇进行醇沉淀，离心并收集醇沉淀物，并依次用无水乙醇、乙醚、丙酮洗涤所述醇沉淀物，喷雾干燥后即得白簕粗多糖；2)Sevage法脱蛋白：将步骤1)中干燥所得白簕粗多糖配制成浓度为2～6mg/mL的白簕粗多糖水溶液，并向该溶液中加入正丁醇-氯仿混合液，剧烈振荡，离心并收集上层溶液，按照上述脱蛋白步骤反复操作2～6次，合并上层溶液，减压浓缩后经喷雾干燥得白簕多糖；3)多糖的分离：①DEAE-cellulose柱层析取步骤2)脱蛋白处理后的白簕多糖，配制成质量浓度为40～60mg/mL的水溶液，离心取上清液用DEAE-cellulose离子柱层析进行初步分离，依次用蒸馏水、氯化钠溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液，合并相同流分后分别进行浓缩、透析、冻干，即得中性多糖ATP1和酸性多糖ATP2、ATP3；②Sephadex柱层析取步骤①中DEAE-cellulose柱层析的中性多糖ATP1，配制成质量浓度为40～60mg/mL的水溶液，用滤膜过滤后，所得滤液经Sephadex层析柱进行提纯分离，用蒸馏水洗脱并收集洗脱液，根据洗脱曲线合并相同流分，浓缩、透析、冻干，即得中性均一的多糖ATP1-1。进一步，所述白簕多糖的分离纯化方法在如下分离条件范围内均可使用，包括如下步骤：1)总多糖的提取：①取干燥的白簕茎粉碎、过20目筛，加入10倍质量的蒸馏水后，于90～100℃浸提两次，每次0.5～4h；②合并提取液，减压浓缩后，于3500～5500r/min离心5～15min，弃去沉淀；向上清液中加入2倍体积的无水乙醇，沉淀12～36h，于3500～5500r/min离心5～15min，收集醇沉物，并依次用无水乙醇、乙醚、丙酮洗涤所述醇沉淀物，于60～90℃喷雾干燥得白簕粗多糖；2)Sevage法脱蛋白：将步骤1)中干燥所得白簕粗多糖配制成浓度为2～6mg/mL的白簕粗多糖水溶液，并向该溶液中加入1/4白簕粗多糖水溶液体积的正丁醇-氯仿混合液(正丁醇-氯仿的体积比1:4)，剧烈振荡15～25min，于3500～5500r/min离心5～15min，收集上层溶液，按照上述脱蛋白步骤反复操作2～6次，合并上层溶液，减压浓缩后经喷雾干燥得白簕多糖；3)多糖的分离：①DEAE-cellulose柱层析取步骤2)脱蛋白处理后的白簕多糖，配制成质量浓度为40～60mg/mL的水溶液，于6000～10000r/min离心5～15min，取上清液用DEAE-cellulose离子柱层析进行初步分离，依次用蒸馏水、浓度为0.05mol/L和0.2mol/L的氯化钠溶液进行梯度洗脱，流速1.3mL/min，收集洗脱液，用苯酚-硫酸法检测洗脱液在检测波长为490nm的吸光度值，根据洗脱曲线合并相同流分，浓缩、透析、冻干，分别得到中性多糖ATP1和酸性多糖ATP2、ATP3；②Sephadex柱层析称取100mg经DEAE-cellulose纯化后的中性多糖ATP1，溶于2mL蒸馏水中，用滤膜过滤后，所得滤液经Sephadex层析柱进行提纯分离，用蒸馏水洗脱，流速0.5mL/min，收集洗脱液，用苯酚-硫酸法检测洗脱液在检测波长为490nm的吸光度值，根据洗脱曲线合并相同流分，浓缩、透析、冻干，即得中性均一的多糖ATP1-1。进一步优选分离条件，所述白簕多糖的分离纯化方法，包括如下步骤：1)总多糖的提取：①取干燥的白簕茎粉碎、过20目筛，加入10倍质量的蒸馏水后，于100℃浸提两次，每次2h；②合并提取液，减压浓缩后，于4500r/min离心10min，弃去沉淀；向上清液中加入2倍体积的无水乙醇，沉淀24h，于4500r/min离心10min离心10min，收集醇沉物，并依次用无水乙醇、乙醚、丙酮洗涤所述醇沉淀物，于80℃喷雾干燥得白簕粗多糖；2)Sevage法脱蛋白：将步骤1)中干燥所得白簕粗多糖配制成浓度为4mg/mL的白簕粗多糖水溶液，并向该溶液中加入1/4白簕粗多糖水溶液体积的正丁醇-氯仿混合液，剧烈振荡20min，于4500r/min离心10min，收集上层溶液，按照上述脱蛋白步骤反复操作4次，合并上层溶液，减压浓缩后经喷雾干燥得白簕多糖；3)多糖的分离：①DEAE-cellulose柱层析取步骤2)脱蛋白处理后的白簕多糖，配制成质量浓度为50mg/mL的水溶液，于8000r/min离心10min，取上清液用DEAE-cellulose离子柱层析进行初步分离，依次用蒸馏水、浓度为0.05mol/L和0.2mol/L的氯化钠溶液进行梯度洗脱，流速1.3mL/min，收集洗脱液，用苯酚-硫酸法检测洗脱液在检测波长为490nm的吸光度值，根据洗脱曲线合并相同流分，浓缩、透析、冻干，分别得到中性多糖ATP1和酸性多糖ATP2、ATP3；②Sephadex柱层析称取100mg经DEAE-cellu本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种白簕多糖的分离纯化方法，其特征在于：白簕茎经热水浸提，对过滤后的浸提液进行醇沉淀，依次用无水乙醇、乙醚、丙酮洗涤所述醇沉淀，喷雾干燥后即得白簕粗多糖；白簕粗多糖经Sevage法脱蛋白后经过DEAE‑cellulose柱层析，分离得到中性多糖ATP1和酸性多糖ATP2、ATP3，中性多糖ATP1经Sephadex柱层析分离提纯后得到中性均一的多糖ATP1‑1。

【技术特征摘要】
1.一种白簕多糖的分离纯化方法，其特征在于：白簕茎经热水浸提，对过滤后的浸提液进行醇沉淀，依次用无水乙醇、乙醚、丙酮洗涤所述醇沉淀，喷雾干燥后即得白簕粗多糖；白簕粗多糖经Sevage法脱蛋白后经过DEAE-cellulose柱层析，分离得到中性多糖ATP1和酸性多糖ATP2、ATP3，中性多糖ATP1经Sephadex柱层析分离提纯后得到中性均一的多糖ATP1-1。2.根据权利要求1所述白簕多糖的分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：1)白簕粗多糖的提取：①取干燥的白簕茎粉碎、过20目筛，加入蒸馏水后，于90～100℃浸提两次，每次0.5～4h；②合并浸提液，减压浓缩后，离心并弃去沉淀，向上清液中加入无水乙醇进行醇沉淀，离心并收集醇沉淀物，并依次用无水乙醇、乙醚、丙酮洗涤所述醇沉淀物，喷雾干燥后即得白簕粗多糖；2)Sevage法脱蛋白：将步骤1)中干燥所得白簕粗多糖配制成浓度为2～6mg/mL的白簕粗多糖水溶液，并向该溶液中加入正丁醇-氯仿混合液，剧烈振荡，离心并收集上层溶液，按照上述脱蛋白步骤反复操作2～6次，合并上层溶液，减压浓缩后经喷雾干燥得白簕多糖；3)多糖的分离：①DEAE-cellulose柱层析取步骤2)脱蛋白处理后的白簕多糖，配制成质量浓度为40～60mg/mL的水溶液，离心取上清液用DEAE-cellulose离子柱层析进行初步分离，依次用蒸馏水、氯化钠溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液，合并相同流分后分别进行浓缩、透析、冻干，即得中性多糖ATP1和酸性多糖ATP2、ATP3；②Sephadex柱层析取步骤①中DEAE-cellulose柱层析的中性多糖ATP1，配制成质量浓度为40～60mg/mL的水溶液，用滤膜过滤后，所得滤液经Sephadex层析柱进行提纯分离，用蒸馏水洗脱并收集洗脱液，根据洗脱曲线合并相同流分，浓缩、透析、冻干，即得中性均一的多糖ATP1-1。3.根据权利要求1所述白簕多糖的分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：1)总多糖的提取：①取干燥的白簕茎粉碎、过20目筛，加入10倍质量的蒸馏水后，于90～100℃浸提两次，每次0.5～4h；②合并提取液，减压浓缩后，于3500～5500r/min离心5～15min，弃去沉淀；向上清液中加入2倍体积的无水乙醇，沉淀12～36h，于3500～5500r/min离心5～15min，收集醇沉物，并依次用无水乙醇、乙醚、丙酮洗涤所述醇沉淀物，于60～90℃喷雾干燥得白簕粗多糖；2)Sevage法脱蛋白：将步骤1)中干燥所得白簕粗多糖配制成浓度为2～6mg/mL的白簕粗多糖水溶液，并向该溶液中加入1/4白簕粗多糖水溶液体积的正丁醇-氯仿混合液(正丁醇-氯仿的体积比1:4)，剧烈振荡15～25min，于3500～5500r/min离心5～15min，收集上层溶液，按照上述脱蛋白步骤反复操作2～6次，合并上层溶液，减压浓缩后经喷雾干燥得白簕多糖；3)多糖的分离：①DEAE-cellulose柱层析取步骤2)脱蛋白处理后的白簕多糖，配制成质量浓度为40～60mg/mL的水溶液，于6000...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘育方，程轩轩，张旭红，杨慧文，陈文露，
申请(专利权)人：广东药科大学，
类型：发明
国别省市：广东;44