一种用于非小细胞肺癌基因突变检测的文库构建方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种可用于非小细胞肺癌基因突变检测的优化的测序文库构建方法和试剂盒。方法包括：一管式反应完成基因组DNA打断至接头连接，连接产物扩增后与非小细胞肺癌相关基因目标区域探针进行杂交捕获，之后进行BGISEQ‑500/1000平台测序及数据分析得到突变发生情况。基于一管式反应极大的优化了实验流程，减少操作复杂性和时间，降低了对临床样本起始量的要求；一次性可检测多基因多位点，覆盖点突变、插入缺失、结构变异及拷贝数变异，检测结果准确并弥补了PCR捕获方法无法一次性检测结构变异的不足，大大提升高通量测序应用于非小细胞肺癌基因突变检测的实效性。本发明专利技术的覆盖面广、性价比高，可为医师诊断、治疗和用药提供参考依据，适于大规模推广应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学
，尤其涉及测序文库构建
，特别涉及一种用于非小细胞肺癌基因突变检测的文库构建方法及试剂盒。
技术介绍
目前，肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，已成为我国城市人口恶性肿瘤死亡原因的第一位，其中大约85％的肺癌为非小细胞肺癌。常规化疗或放疗会严重影响患者的生活质量和身体素质，所以靶向治疗越来越受到重视。针对非小细胞肺癌，已有的科学研究和临床实验已经找出了一系列靶向治疗位点和药物。靶向治疗与传统的化疗法不同，不干扰所有持续分裂细胞，而是通过药物干扰癌变或肿瘤增生所需的特定分子，从而特异的阻止癌细胞增长。药物进入体内会特异地选择致癌位点来相结合发生作用，使肿瘤细胞特异性死亡，而不会波及肿瘤周围的正常组织细胞。与传统的放化疗相比，靶向治疗不仅可以减少毒副反应，而且可以显著提高治疗的有效性，显著延长病人的生存期并提高生存质量。在2016年《非小细胞肺癌靶向药物治疗相关基因检测的规范建议》中，对靶向药物检测基因有相关说明，可以用于或推荐在非小细胞肺癌(NSCLC)检测的基因包括：EGFR、ALK和ROS1融合基因、c-MET、RET、BRAF和KRAS。通过基因检测，明确非小细胞肺癌的分子分型，找到可能的靶药位点或耐药位点，可为患者提供更精准的用药指导。目前，高通量测序技术已广泛应用到医学研究和临床诊断领域，为致癌位点的检测提供了新的检测手段。高通量测序技术因其结果覆盖范围的全面性，以及不断下降的测序成本，在医学研究和临床应用中表现出越来越高的性价比。有限的样本量和检测报告输出的时效性对该技术提出了更高的要求。简化文库构建流程、提高低起始量样本的建库成功率势在必行。通过优化和改进文库构建方法，缩短酶反应时间和建库步骤、提高样本转化成文库的效率成为高通量测序技术拓展应用领域的一大关键点。经典的高通量文库构建步骤包括：1.基因组打断(包括物理打断法和化学打断法，如covaris超声打断、fragmentase酶切打断)；2.双链DNA(Deoxyribonucleicacid，脱氧核糖核酸)末端修复；3.3’末端加dATP(deoxyadenosinetriphosphate,三磷酸脱氧腺苷)；4.加与测序平台匹配的接头；5.PCR(PolymeraseChainReaction，聚合酶链式反应)扩增。每个步骤间都需要进行纯化反应，有时还需要在酶反应之后进行一次片段选择(步骤1、4、5其中之一)，整个流程需要大概8-9个小时才能完成。为简化流程，一些生物公司推出了新的建库技术，如illumina公司提出了基于转座酶的打断与加接头一步完成的快速建库方法，但该方法存在测序数据碱基偏向性问题。如上所述，经典的高通量文库构建方法是目前接受度最广、数据表现最稳定、数据偏向性最少的建库方法，但其建库过程耗时较长，对样本起始量要求较高，日益无法满足快速发展的市场对低起始量微量建库和快速报告周期的需求，这一点在高通量测序技术在临床方面的应用中表现的更为突出。而转座酶建库技术，虽然能够满足低起始量和快速建库的要求，但其数据偏向性又在一定程度上限制了该方法的大范围推广。所以如果能对经典的高通量建库方法进行改良，在保持其现有优势的基础上降低其所需的样本起始量并缩短建库时间，将极大的推进高通量测序方法在市场上特别是医学研究和临床方向的应用，为相关领域研究和临床应用提供更有利的方法和技术。本专利技术中的方法对经典的高通量文库构建方法进行了优化改进，使其在保持现有数据表现优势的基础上，兼容不同样本类型(包括低质量的福尔马林固定石蜡包埋样本)，可进行微量样本建库，极大的简化了操作流程，减少样本在建库过程中的损失，大大缩短了建库时间，并降低了文库构建成本，更有利于非小细胞肺癌基因检测大规模的推广应用。目前市面上主要的基因检测产品大部分一次检测只能针对少数基因与位点，且不同的突变类型需要采用不同的起始样本类型或检测方法。如基于ArmsPCR方法的检测试剂盒，在检测SNV和InDel时使用DNA样本，每次检测一个或数个基因，检测更全面基因或位点则需进行多次检测，造成时间和成本的增加；而在检测融合基因变异时，需要采用RNA样本，并只能检测已知的融合类型。另外临床上对于融合和拷贝数变异的检测常用的还有FISH方法，该方法一次检测一般针对单个基因，且这一方法灵敏度和准确度相对较低，对需要操作人员的要求和经验较高，价格昂贵。然后，使用本专利技术中的试剂盒，可以通过一次DNA建库测序检测几百个肺癌相关基因和几千个热点，并检测所有突变类型，包括点突变、插入缺失、基因融合以及拷贝数变异，涵盖所有非小细胞肺癌靶向药物作用位点，大大节省了样本需求量，避免不同核酸类型提取带来的复杂操作，节约宝贵的临床样本。本试剂盒中优化的实验流程大大提高了核酸的利用率，检测结果准确，对于四种突变类型的检出均有非常好的灵敏度、特异性和准确性。本试剂盒优化的实验操作步骤使得检测过程更加简单便捷，进一步减少检测成本和人工成本，更低的成本带来高性价比最终能够更好的使患者获益。
技术实现思路
本专利技术提供一种优化的可用于非小细胞肺癌基因突变检测的测序文库构建方法和试剂盒。本方法能够在同一个反应管中实现DNA打断、末端修复与加A、以及接头连接反应，之后对连接产物的扩增产物进行非小细胞肺癌相关基因目标区域杂交捕获并测序，通过信息分析探明非小细胞肺癌基因突变情况。本专利技术提供一种优化的可用于非小细胞肺癌基因突变检测的文库构建试剂盒，为临床提供了更加安全、准确、灵敏、便捷、高性价比的基因突变检测手段。解决了当前临床方法中无法依靠少量的DNA样本一次性全面检测点突变、插入缺失、融合基因和拷贝数变异的问题，极大的节省了珍贵临床样本的需求量。检测结果准确，可以在较短时间为医生提供全面、精准的基因突变信息，也为患者节省了因多次检测浪费的宝贵时间和金钱。试剂盒简便优化的操作步骤，一定程度上降低了NGS建库操作的复杂性，减少的出错机率，进一步提高了产品在临床应用中的安全性。在本专利技术中，末端修复与加A在相同的反应体系中实现，简化了反应过程，减少了纯化步骤，提高了起始DNA转化成可连接接头DNA的效率，降低对起始DNA总量的要求，也可降低PCR扩增的循环数，提高上机文库的可用数据比率并且降低数据碱基偏向性。本专利技术的方法适用于不同类型微量起始DNA的快速建库。在本专利技术的用于非小细胞肺癌基因突变检测的文库构建方法的基础上，本专利技术还提供一种用于非小细胞肺癌基因突变检测的文库构建试剂盒。根据本专利技术的第一方面，本专利技术提供一种用于非小细胞肺癌基因突变检测的文库构建方法，包括：在反应管中加入基因组DNA，DNA打断酶和打断反应缓冲液；在DNA打断酶的作用下，基因组DNA被随机片段化处理，产生DNA分子片段；在所述反应管中，直接加入聚合酶、多聚核苷酸激酶、不具有3’-5’外切活性的聚合酶、dNTP、dATP及多聚核苷酸激酶缓冲液，进行末端修复与加A反应；在同一反应体系中，在dNTP存在下，利用聚合酶将片段化DNA的末端补平或切平，例如利用聚合酶的5’-3’聚合活性将5’突出末端补平和/或聚合酶的3’-5’外切活性将3’突出末端切平，利用多聚核苷酸激酶将5’羟基转变成5’磷酸基团且将3’磷酸基团转变成3’本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于非小细胞肺癌相关基因突变检测的文库构建方法，其特征在于，所述方法包括：i.在反应管中加入基因组DNA，DNA打断酶和打断反应缓冲液；在DNA打断酶的作用下，基因组DNA被随机片段化处理，产生DNA分子片段；ii.在所述反应管中，直接加入聚合酶、多聚核苷酸激酶、不具有3’‑5’外切活性的聚合酶、dNTP、dATP及多聚核苷酸激酶缓冲液，进行末端修复与加A反应；在同一反应体系中，在dNTP存在下，利用聚合酶将片段化DNA的末端补平或切平，利用多聚核苷酸激酶将5’羟基转变成5’磷酸基团且将3’磷酸基团转变成3’羟基；在过量dATP存在下，利用不具有3’‑5’外切活性的聚合酶在双链DNA 3’末端加上dATP；iii.在所述反应体系中，直接加入鼓泡型接头、DNA连接酶和连接反应缓冲液，所述鼓泡型接头的一端为单碱基突出末端；所述单碱基突出末端为T，其位于所在链的3’端；使上一步产生的3’A突出的双链DNA与所述鼓泡型接头连接；iv.纯化上一步接头连接的产物后，加入与所述接头序列两端互补的核酸单链作为引物进行PCR扩增，其中一条引物5’末端有磷酸化修饰，得到大量双链DNA，其中一条链的5’端有磷酸基团；v.使用非小细胞肺癌探针对上一步PCR扩增得到的产物进行非小细胞肺癌目标区域捕获；vi.对上一步非小细胞肺癌目标区域捕获的产物，加入与所述接头序列两端互补的核酸单链作为引物进行PCR扩增，其中一条引物5’末端有磷酸化修饰，得到大量双链DNA，其中一条链的5’端有磷酸基团；vii.纯化上一步PCR扩增的产物后，利用热变性将所述双链DNA变成单链脱氧核酸，并加入一段与接头首尾序列互补的单链核酸作为介导桥序列，与变性后的单链脱氧核酸杂交及连接反应，使目的单链核酸环化，得到所述文库。...

【技术特征摘要】
1.一种用于非小细胞肺癌相关基因突变检测的文库构建方法，其特征在于，所述方法包括：i.在反应管中加入基因组DNA，DNA打断酶和打断反应缓冲液；在DNA打断酶的作用下，基因组DNA被随机片段化处理，产生DNA分子片段；ii.在所述反应管中，直接加入聚合酶、多聚核苷酸激酶、不具有3’-5’外切活性的聚合酶、dNTP、dATP及多聚核苷酸激酶缓冲液，进行末端修复与加A反应；在同一反应体系中，在dNTP存在下，利用聚合酶将片段化DNA的末端补平或切平，利用多聚核苷酸激酶将5’羟基转变成5’磷酸基团且将3’磷酸基团转变成3’羟基；在过量dATP存在下，利用不具有3’-5’外切活性的聚合酶在双链DNA3’末端加上dATP；iii.在所述反应体系中，直接加入鼓泡型接头、DNA连接酶和连接反应缓冲液，所述鼓泡型接头的一端为单碱基突出末端；所述单碱基突出末端为T，其位于所在链的3’端；使上一步产生的3’A突出的双链DNA与所述鼓泡型接头连接；iv.纯化上一步接头连接的产物后，加入与所述接头序列两端互补的核酸单链作为引物进行PCR扩增，其中一条引物5’末端有磷酸化修饰，得到大量双链DNA，其中一条链的5’端有磷酸基团；v.使用非小细胞肺癌探针对上一步PCR扩增得到的产物进行非小细胞肺癌目标区域捕获；vi.对上一步非小细胞肺癌目标区域捕获的产物，加入与所述接头序列两端互补的核酸单链作为引物进行PCR扩增，其中一条引物5’末端有磷酸化修饰，得到大量双链DNA，其中一条链的5’端有磷酸基团；vii.纯化上一步PCR扩增的产物后，利用热变性将所述双链DNA变成单链脱氧核酸，并加入一段与接头首尾序列互补的单链核酸作为介导桥序列，与变性后的单链脱氧核酸杂交及连接反应，使目的单链核酸环化，得到所述文库。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因组DNA为手术冷冻组织DNA、福尔马林固定石蜡包埋DNA或穿刺组织DNA。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚合酶为T4DNA聚合酶和/或Klenow大片段；所述多聚核苷酸激酶为T4多聚核苷酸激酶；所述不具有3’-5’外切活性的聚合酶为Taq聚合酶和/或Klenow片段(3′→5′exo-)。4....

【专利技术属性】
技术研发人员：于竞，毕书琳，林木飞，刘轶颖，陈龙昀，陈焱，曾爽，朱师达，蒋慧，
申请(专利权)人：深圳华大基因研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44