一种可诱导调控的标记蛋白表达框及其构建的重组载体与应用制造技术

本发明专利技术涉及到一种可诱导调控的标记蛋白表达框及其构建的重组载体与应用。利用筛选标记蛋白和可诱导调控元件构建可诱导调控的筛选标记蛋白表达框，然后通过可诱导调控的筛选标记蛋白表达框制备得到以大肠杆菌毒性蛋白为筛选标记的重组载体，利用该重组载体控制大肠杆菌毒性蛋白在二次同源重组时表达，杀死或抑制只发生一次同源重组菌株的生长，而发生二次同源重组菌株生长不受限制，从而提高二次同源重组菌株的筛选效率，其简化了芽孢杆菌同源重组法敲入或敲出基因的操作流程，减少了操作难度，降低了劳动强度能够很好地应用于芽孢杆菌基因敲出与外源基因导入芽孢杆菌中。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学领域，实际在芽孢杆菌属(Bacillus)物种中敲出和敲入基因。具体的本专利技术涉及到以大肠杆菌毒性蛋白ccdB和mazF为筛选标记蛋白的芽孢杆菌基因敲出、敲入的方法。
技术介绍
芽孢杆菌(Bacillus)是一类好氧型、内生抗逆性孢子的革兰氏阳性细菌。芽孢杆菌属中有许多可以作为表达外源蛋白的宿主，如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、凝固芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)等。利用上述芽孢杆菌可以工业化的生产碱性蛋白酶、淀粉酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、纤维素酶、生长激素、白细胞介素、青霉素酰化酶、核黄素、嘌呤核苷酸、链霉亲和素等广泛应用范围的产物。外源蛋白在芽孢杆菌中的表达主要分为两种方式：一是外源蛋白基因存在于可在芽孢杆菌中自主复制的质粒上，二是将外源蛋白基因整合到芽孢杆菌的基因组上。以质粒形式存在于细胞中外源蛋白基因容易在细胞复制、分裂时丢失，或被细胞本身的限制修饰系统降解。在没有外在筛选压力情况下，质粒很难稳定存在于细胞中。所以该方法主要适用于在实验室中研究外源蛋白在芽孢杆菌中表达的可能性以及研究外源蛋白的理化性质，并不适用于大规模的发酵生产。当外源基因整合到芽孢杆菌基因组上，就能在没有外界压力(如抗生素、生长因子)条件下稳定的存在。产量稳定，发酵条件简单，适应大规模发酵生产的需要。染色体整合即采用整合载体(或称整合质粒)携带外源基因进入表达宿主后，整合载体连同外源基因表达单元进入染色体并随染色体的复制而复制和表达。整合载体的染色体整合模式有：单交换同源重组(Single-crossoverRecombination)、双交换同源重组(Double-crossoverRecombination)和位点专一性重组(Site-specificRecombination)等方式。单交换同源重组只有一条同源臂，通过单交换的方式将整个质粒或者片段整合到预定的位置。但是单交换同源重组存在脱靶率高的缺陷，或者会将抗性基因引入到芽孢杆菌的基因组中。位点专一性重组需要有特异性的位点，载体上需要有特定的整合酶。目前采用最广泛的为双交换同源重组，在简单的双交换同源重组系统中，仅需要上下游同源臂和目的基因片段即可转化芽孢杆菌实现双交换重组，但是在这种体系中无法克服重组效率低的缺陷，以及芽孢杆菌转化效率低，无法得到转化子的事实。随后，科研人员发展出各种类型的双交换同源重组系统，提高同源重组的效率，极大地促进了芽孢杆菌作为工业表达宿主的发展。
技术实现思路
本专利技术的目的在于为了克服以上现有技术的不足而提供一种可诱导调控的标记蛋白表达框及其构建的重组载体与应用，通过可诱导启动子调控筛选标记蛋白的表达，作为筛选的条件，提高二次重组的筛选效率。该方法具有方便、快捷，简单易行的优点。极大地提高了双交换同源重组方法敲入外源基因或敲出芽孢杆菌基因组基因的筛选效率。本专利技术的技术方案如下：一种可诱导调控的标记蛋白表达框，包括筛选标记蛋白和可诱导调控元件；其中筛选标记蛋白为大肠杆菌毒性蛋白包括ccdB、mazF、密码子优化后的ccdB或密码子优化后的mazF中的任意一种；可诱导调控元件包括IPTG诱导的内含乳糖操作子的grac启动子、木糖诱导的木糖xylA启动子、密码子优化后的IPTG诱导的内含乳糖操作子的grac启动子或密码子优化后的木糖诱导的木糖xylA启动子中的任意一种。所述的可诱导调控的标记蛋白表达框，密码子优化后的ccdB为使用引物ATGCAATTCAAAGTTTACACATAC和TTAGATGCCCCAGAACATA扩增ccdB基因得到；密码子优化后的mazF为使用引物ATGGTTTCTCGTTACGTTCCTGA和TTAGCCGATAAGAACGTTGAT扩增mazF基因得到。所述的可诱导调控的标记蛋白表达框，密码子优化后的IPTG诱导的内含乳糖操作子的grac启动子为使用引物CAACTTCTTTAACATAACCGT和TGATCCTTCCTCCTTTAATTG扩增内含乳糖操作子的grac启动子得到；密码子优化后的木糖诱导的木糖xylA启动子为使用引物GATCTTCTTTTCTAACAACG和TGATTTCCCCCTTAGATGA扩增木糖诱导的木糖xylA启动子得到。所述的可诱导调控的标记蛋白表达框，大肠杆菌毒性蛋白ccdB的序列如SEQIDNO.5所示，mazF的序列如SEQIDNO.7所示；密码子优化后的ccdB序列如SEQIDNO.6所示，密码子优化后的mazF序列如SEQIDNO.8所示。所述的可诱导调控的标记蛋白表达框，IPTG诱导的内含乳糖操作子的grac启动子序列如SEQIDNO.1所示，木糖诱导的木糖xylA启动子序列如SEQIDNO.3所示；密码子优化后的IPTG诱导的内含乳糖操作子的grac启动子序列如SEQIDNO.2所示，密码子优化后的木糖诱导的木糖xylA启动子序列如SEQIDNO.4所示。所述的可诱导调控的标记蛋白表达框用于整合在任何在芽孢杆菌中自由复制的重组载体上，该载体包括pCBS、pMAD、pBesT502、pDG1663、pAX01、pSAS144、pDL、pDG148-stu、pSG1154、pMUTIN4M、pMUTIN-FLAG、pMUTIN-GFP+、pDG641、pBGSC6、pCP115或pDG364中的任意一种。一种以大肠杆菌毒性蛋白为筛选标记的重组载体，以以上所述任意一种筛选标记蛋白和任意一种可诱导调控元件通过重叠延伸PCR的方式连接到一起得到。所述的以大肠杆菌毒性蛋白为筛选标记的重组载体，重叠延伸PCR过程为通过可诱导调控元件的正向引物和筛选标记蛋白的反向引物，以可诱导调控元件基因、筛选标记蛋白基因为模板重叠延伸，得到目的片段。所述的重组载体在芽孢杆菌基因敲出与外源基因导入芽孢杆菌中的应用。以上所述的应用，芽孢杆菌基因敲出具体为选择以上所述的重组载体，以芽孢杆菌的基因组为模板，扩增待敲出基因上下游同源臂；然后将重组载体通过限制性内切酶酶切后分别与待敲出基因的上、下游同源臂连接，再转化芽孢杆菌，在对应抗性平板上培养后得到转化子，通过提高培养温度，添加诱导剂诱导标记蛋白表达的方法得到待敲出基因被敲出的重组菌株。以上所述的应用，外源基因导入芽孢杆菌具体为选择以上所述的重组载体，芽孢杆菌的基因组为模板，扩增待替换基因上下游同源臂；然后将重组载体通过限制性内切酶酶切后分别与待替换基因的上、下游同源臂连接；将外源基因引入表达载体，然后转化芽孢杆菌，在对应抗性平板上培养后得到转化子，通过提高培养温度，添加诱导剂诱导标记蛋白表达的方法得到待替换基因被外源基因替换的重组菌株。本专利技术以前期构建的芽孢杆菌整合载体pCBS(见图1)为骨架，通过可本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可诱导调控的标记蛋白表达框，其特征在于，包括筛选标记蛋白和可诱导调控元件；其中筛选标记蛋白为大肠杆菌毒性蛋白包括ccdB、mazF、密码子优化后的ccdB或密码子优化后的mazF中的任意一种；可诱导调控元件包括IPTG诱导的内含乳糖操作子的grac启动子、木糖诱导的木糖xylA启动子、密码子优化后的IPTG诱导的内含乳糖操作子的grac启动子或密码子优化后的木糖诱导的木糖xylA启动子中的任意一种。

【技术特征摘要】
1.一种可诱导调控的标记蛋白表达框，其特征在于，包括筛选标记蛋白和可诱导调控元件；其中筛选标记蛋白为大肠杆菌毒性蛋白包括ccdB、mazF、密码子优化后的ccdB或密码子优化后的mazF中的任意一种；可诱导调控元件包括IPTG诱导的内含乳糖操作子的grac启动子、木糖诱导的木糖xylA启动子、密码子优化后的IPTG诱导的内含乳糖操作子的grac启动子或密码子优化后的木糖诱导的木糖xylA启动子中的任意一种。2.根据权利要求1所述的可诱导调控的标记蛋白表达框，其特征在于，密码子优化后的ccdB为使用引物ATGCAATTCAAAGTTTACACATAC和TTAGATGCCCCAGAACATA扩增ccdB基因得到；密码子优化后的mazF为使用引物ATGGTTTCTCGTTACGTTCCTGA和TTAGCCGATAAGAACGTTGAT扩增mazF基因得到。3.根据权利要求1所述的可诱导调控的标记蛋白表达框，其特征在于，密码子优化后的IPTG诱导的内含乳糖操作子的grac启动子为使用引物CAACTTCTTTAACATAACCGT和TGATCCTTCCTCCTTTAATTG扩增内含乳糖操作子的grac启动子得到；密码子优化后的木糖诱导的木糖xylA启动子为使用引物GATCTTCTTTTCTAACAACG和TGATTTCCCCCTTAGATGA扩增木糖诱导的木糖xylA启动子得到。4.根据权利要求1所述的可诱导调控的标记蛋白表达框，其特征在于，大肠杆菌毒性蛋白ccdB的序列如SEQIDNO.5所示，mazF的序列如SEQIDNO.7所示；密码子优化后的ccdB序列如SEQIDNO.6所示，密码子优化后的mazF序列如SEQIDNO.8所示。5.根据权利要求1所述的可诱导调控的标记蛋白表达框，其特征在于，IPTG诱导的内含乳糖操作子的grac启动子序列如SEQIDNO.1所示，木糖诱导的木糖xylA启动子序列如SEQIDNO.3所示；密码子优化后的IPTG诱导的内含乳糖操作...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆兆新，孟凡强，李金良，李春燕，
申请(专利权)人：南京福斯弗瑞生物科技有限公司，南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32