一种快速高效的甘蓝型油菜毛状根诱导及培养方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种快速高效的甘蓝型油菜毛状根诱导及培养方法。该方法使用农杆菌重悬液重悬活化后的发根农杆菌；在生长2周的无菌甘蓝型油菜幼苗的近子叶端下胚轴处制造伤口；用发根农杆菌重悬液侵染伤口处；继续无菌培养侵染后的幼苗，在伤口处产生毛状根；将带有毛状根的下胚轴切下后，培养获得无菌的毛状根；将毛状根的根尖切下在继代培养基中培养可获得大量毛状根。本发明专利技术中使用的发根农杆菌可为野生型发根农杆菌，也可以为转入带有目的基因的发根农杆菌。野生型发根农杆菌诱导产生的毛状根可以用于根生理研究或次级代谢物的生产，而带有目的基因的农杆菌诱导产生的毛状根可以用于特定基因或启动子等组件的功能研究。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种快速高效的甘蓝型油菜毛状根诱导及培养方法。
技术介绍
由于甘蓝型油菜生长期长，基因遗传转化困难，长期以来其基因功能的研究受到一定的限制，特别是基因表达定位、启动子特性、反向遗传学研究及某些假说的验证等方面受到的限制更多。部分研究可以在亲缘关系较近的模式植物拟南芥中快速进行，但不同物种间的研究结论并不十分可靠，因为在模式植物中的研究通常不能完全复现细胞环境的影响。如许多根部表达的启动子在番茄和拟南芥中的表达模式存在显著差异(Ron,M.,etal.HairyroottransformationusingAgrobacteriumrhizogenesasatoolforexploringcelltype-specificgeneexpressionandfunctionusingtomatoasamodel.PlantPhysiology.Vol.166,pp.455–469,2014)。因此，发展一种方便快速的在甘蓝型油菜中进行基因功能的研究方法非常必要。发根农杆菌诱导产生的毛状根与植物初生根的结构特征一致，但生长快、培养方式简单，并且可以通过导入外源基因使毛状根表达目的蛋白，是基因功能快速研究的良好载体。另外，毛状根也可用于某些甘蓝型油菜次级代谢物的生产来源。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种快速高效的甘蓝型油菜毛状根根产生、培养及筛选方法。本专利技术技术方案包括以下步骤：1)使用农杆菌重悬液重悬活化后的发根农杆菌；2)在生长2周的无菌甘蓝型油菜幼苗的近子叶端下胚轴处制造伤口；3)用发根农杆菌重悬液侵染伤口处；4)继续无菌培养侵染后的幼苗，在伤口处产生毛状根；5)将带有毛状根的下胚轴切下后，在除菌培养基中培养，获得无菌的毛状根；6)将毛状根的根尖切下，在继代培养基中培养，可获得大量毛状根用于后续试验。其特征在于所述步骤1)中，农杆菌K599使用含合适浓度的相应抗生素的LB液体培养至饱和后，取1ml菌液离心去上清，用10ml农杆菌重悬液重悬；优选地，所述农杆菌重悬液的配方为：4.4g/LMS粉末，20g/L蔗糖，200μM乙酰丁香酮(AS)，500mg/l聚乙烯吡咯烷酮，pH5.8。步骤2)中，在无菌条件下，用锋利的刀片或手术刀将生长2周的无菌油菜幼苗距子叶约1cm处的下胚轴划开一个长约0.5cm的伤口，但伤口不能穿透下胚轴。步骤3)中，在无菌苗条件下用移液器吸取1～20μl发根农杆菌重悬液滴在下胚轴的伤口处。步骤2)和步骤4)中培养条件为光周期光照16h，黑暗8h，环境温度24℃，光照强度7000lux。通常对甘蓝型油菜基因或启动子的研究首先在其同源模式植物拟南芥中进行，如通过拟南芥瞬时表达检测蛋白亚细胞定位，通过拟南芥遗传转化鉴定蛋白的生理功能等。而以甘蓝型油菜作为遗传转化的材料通常试验周期为3个月以上，且操作繁琐，工作量大。本专利技术以发根农杆菌介导产生的毛状根为材料，研究基因功能和根部生理，既可保证研究中的细胞环境，又大大节约了试验时间。毛状根诱导通常用于次级代谢物，如人参、柴胡等中药的有效成分的生产，也用于对植物生理功能，如对重金属污染、根部寄生虫的生理响应等理论研究。但目前在甘蓝型油菜中进行的毛状根诱导研究较少，且其毛状根诱导效率也较低(宗晓秋等,发根农杆菌诱导大豆毛状根体系的建立.华中农业大学学报,2012(06):第699-703页.)。本专利技术针对这一不足，优化了农杆菌侵染液的配方及侵染条件：使用活体侵染而不是常规的外植体侵染的方法基本杜绝了不定根产生，大大降低了筛选阳性根的工作量。在侵染液中加入聚乙烯吡咯烷酮有效提升了诱导效率，使诱导效率达到80％左右，且单个植株产生的毛状根较多。此外，本方法操作方便，不用进行繁琐的外植体制备工作，节省大量人力和成本。本专利技术中使用的发根农杆菌可为野生型发根农杆菌，也可以为转入带有目的基因的发根农杆菌。野生型发根农杆菌诱导产生的毛状根可以用于根生理研究或次级代谢物的生产，而带有目的基因的农杆菌诱导产生的毛状根可以用于特定基因或启动子等组件的功能研究。附图说明图1发根农杆菌K599侵染活体甘蓝型油菜下胚轴及毛状根的产生：甘蓝型油菜无菌苗下胚轴被侵染后，产生多条毛状根。箭头为切出伤口，并使用无农杆菌的重悬液涂抹伤口的非侵染对照。图2毛状根离体培养：将生出毛状根的甘蓝型油菜下胚轴切下，在筛选培养基上培养2周后毛状根的生长状态。图3将毛状根的根尖进行GUS染色后结果。图4pCAMBIA-1303双元表达载体图谱。具体实施方式1农杆菌培养农杆菌菌种为使用化学转化法获得的含pCAMBIA-1303双元表达载体的K599发根农杆菌以及不含双元表达载体的野生型K599菌种。野生型K599菌种购自NationalCollectionofPlantPathogenicBacteria。pCAMBIA-1303双元表达载体(PaulaM.Olhoft,LexE.Flagel,DavidA.Somers.T-DNAlocusstructureinalargepopulationofsoybeanplantstransformedusingtheAgrobacterium-mediatedcotyledonary-nodemethod.PlantBiotechnologyJournal.2(2004),pp.289–300)，其图谱如图4。将-80℃保存的K599菌种在LB+50mg/mlRif(利福平)+100mg/lKana(卡那霉素)或LB+50mg/mlRif(利福平)的固体培养基上划线活化，28℃培养36～48h，挑取单菌落于LB+50mg/mlRif(利福平)+100mg/lKana(卡那霉素)或LB+50mg/mlRif(利福平)液体培养基中，200～220r/min，28℃培养12～16h，菌液浓度OD600>0.8的菌液作为菌种用于进一步实验。2甘蓝型油菜材料准备甘蓝型油菜品种“扬油9号”种子为本实验室保存。该品种为江苏省常见种植品种，可在江苏省各种子商店购买。按常规种子消毒方法为“扬油9号”种子消毒(75％乙醇消毒2min，50％次氯酸钠消毒15min)，培养条件为光照16h，黑暗8h，24℃，光照7000lux。在培养瓶中培养14天作为诱导毛状根的受体材料。3毛状根的诱导吸取过夜培养的K599菌液按1:200接种至LB+50mg/mlRif(利福平)+100mg/lKana(卡那霉素)或LB+50mg/mlRif(利福平)液体培养基中培养16h，至OD600>2.0。取1ml菌液离心，用10ml重悬液重悬待用。将生长2周的无菌油菜幼苗在距子叶约1cm的下胚轴处用手术刀小心划开一个长约0.5cm的伤口(注意不要穿透下胚轴)，用移液器吸取5μl农杆菌重悬液滴加在伤口处。侵染后的幼苗在相同条件下继续培养。如图1所示，在侵染后10～15天时，在伤口处成功诱导出多条毛状根，而箭头所示的无农杆菌K599侵染的伤口未产生毛状根。4.毛状根的培养在侵染后约10～20天，当丛生的毛状根从侵染处生出时，用手术刀将长有毛状根的下胚轴从伤口上下侧各约0.5cm处切下，置于除菌培养基(4.4g/lMS本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速高效的甘蓝型油菜的毛状根诱导及培养方法，其特征在于包括以下步骤：1)使用农杆菌重悬液重悬活化后的发根农杆菌；2)在生长2周的无菌甘蓝型油菜幼苗的近子叶端下胚轴处制造伤口；3)用发根农杆菌重悬液侵染伤口处；4)继续无菌培养侵染后的幼苗，在伤口处产生毛状根；5)将带有毛状根的下胚轴切下后，在除菌培养基中培养，获得无菌的毛状根；6)将毛状根的根尖切下，在继代培养基中培养，可获得大量毛状根。

【技术特征摘要】
1.一种快速高效的甘蓝型油菜的毛状根诱导及培养方法，其特征在于包括以下步骤：1)使用农杆菌重悬液重悬活化后的发根农杆菌；2)在生长2周的无菌甘蓝型油菜幼苗的近子叶端下胚轴处制造伤口；3)用发根农杆菌重悬液侵染伤口处；4)继续无菌培养侵染后的幼苗，在伤口处产生毛状根；5)将带有毛状根的下胚轴切下后，在除菌培养基中培养，获得无菌的毛状根；6)将毛状根的根尖切下，在继代培养基中培养，可获得大量毛状根。2.根据权利要求1所述甘蓝型油菜的毛状根诱导及培养方法，其特征在于所述步骤1)中，农杆菌K599使用含合适浓度的相应抗生素的LB液体培养至饱和后，取1ml菌液离心去上清，用10ml农杆菌重悬液重悬。3.根据权利要求1和2所述甘蓝型油菜的毛状根诱导及培养方法，其特征在于所述农杆...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙勤富，王幼平，吴健，蒋金金，李玉兰，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32