一株过表达lae1基因的木霉工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术涉及一株过表达lae1基因的木霉工程菌及其构建方法与应用。构建方法包括如下步骤：(1)从木霉SMF2提取基因组DNA，经PCR扩增，制得lae1基因ORF区及终止子序列；(2)将lae1基因ORF区及终止子序列经酶切后，与同样酶切的载体连接，制得重组质粒；(3)将重组质粒转化感受态细胞，制得过表达质粒；(4)将过表达质粒经酶切线性化，然后转化原生质体，制得过表达lae1基因的木霉工程菌。本发明专利技术构建的过表达lae1基因的木霉工程菌能够显著提高木霉peptaibols的产量，有助于木霉peptaibols在医药和农业上的应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一株过表达lae1基因的木霉工程菌及其构建方法与应用，属于生物工程

技术介绍
木霉(Trichodermaspp.)是一类重要的真菌资源，是工业上重要的酶制剂生产菌株，也是农业生产中重要的生防制剂和植物生长促进剂的生产菌株。木霉能够产生多种次级代谢产物，这些次级代谢产物在木霉与病原生物、木霉与植物的相互作用过程中发挥着重要的作用。Peptaibols是丝状真菌产生的一类富含α-氨基异丁酸(Aib)的特殊肽类次级代谢产物，其分子量通常在500～2200Da，含有5～20个氨基酸残基，多数为15～20个残基；其N-末端烷基化(通常乙酰化)，C-末端羟基化，通常为苯丙氨醇(Benedettietal.,1982)。Peptaibols两亲性的结构特性使其多个分子在脂双层膜上能够形成电荷依赖的离子通道，是研究生物大分子与生物膜相互作用的重要生物活性肽。研究还发现peptaibols具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、诱导植物产生抗性等多种生物学活性，其在农业和医药领域都具有很好的应用潜力。木霉是peptaibols类次级代谢产物的主要产生菌株，已发现的peptaibols80％来源于木霉属真菌，尤其是T.viride，T.brevicompactum，T.virens，T.parceramosum和T.harzianum。我们筛选到的木霉SMF2菌株能够产生含有20个氨基酸残基的长链peptaibols组分TrichokoninsA和含有11个氨基酸残基的中长链peptaibols组分TrichokoninsB，其中产量最高的组分是长链peptaibols组分TrichokoninVI。研究发现，TrichokoninVI具有广谱的抗菌活性，能够抑制革兰氏阳性细菌和真菌的生长，诱导真菌细胞的程序化死亡；通过激活Ca2+信号转导途径引起肝癌细胞系HepG2的凋亡和自噬；通过激活以水杨酸信号转导途径为主的防御反应机制来诱导植物产生抗性等多种生物学活性。Peptaibols是非核糖体合成肽，含有大量的非蛋白源的氨基酸残基，不能采用现有的多肽化学合成方法生产，因此生物合成是其主要的生产方法，但目前的产量较低，缺乏高效的生产菌株。Sigmaaldrich公司的Alamethicin是仅有的商品化peptaibols，且价格昂贵，无法满足peptaibols在农业和医药领域的应用。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一株过表达lae1基因的木霉工程菌及其构建方法与应用。本专利技术的技术方案如下：一株过表达lae1基因的木霉工程菌的构建方法，包括如下步骤：(1)从木霉SMF2提取基因组DNA，然后以制得的基因组DNA为模板进行PCR扩增，制得lae1基因ORF区及终止子序列；所述lae1基因ORF区及终止子序列的PCR特异引物序列如下：lae1OE-F：CATGccatggCCTCTCGAAACGCTCCCAAC；lae1OE-R：CCCaagcttCTAGCTAACCTGTTGCTGTAC；(2)将步骤(1)制得的lae1基因ORF区及终止子序列经NcoI和HindIII双酶切后，与同样经NcoI和HindIII双酶切的载体pIG-1783进行连接，制得重组质粒；(3)将步骤(2)制得的重组质粒转化E.coliDH5α感受态细胞，经含氨苄青霉素Amp的LB培养基筛选，提取重组表达载体，制得过表达质粒pIG1783-lae1OE；(4)将步骤(3)制得的过表达质粒pIG1783-lae1OE经HindIII酶切线性化，然后转化原生质体，经再生、初筛、复筛，制得过表达lae1基因的木霉工程菌。所述步骤(1)中木霉SMF2基因组DNA的提取参照真菌DNA提取试剂盒(E.Z.N.A.TMFungalDNAMiniKit，OMEGA)说明书进行。根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中lae1基因ORF区及终止子序列的PCR扩增体系如下，总体系为50μL：所述PCR扩增程序如下：95℃预变性5min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃终延伸5min。根据本专利技术优选的，所述步骤(2)中NcoI和HindIII双酶切反应体系如下，总体系为20μL：NcoI和HindIII双酶切反应条件为：37℃温浴30min。根据本专利技术优选的，所述步骤(2)中的连接采用T4连接酶进行连接，反应条件为：16℃连接过夜。连接反应体系参照Promega公司的T4连接酶试剂盒，反应体系为10μL。根据本专利技术优选的，所述步骤(3)中转化E.coliDH5α感受态细胞的步骤如下：取-80℃保存的E.coliDH5α感受态细胞冰浴融化，将重组质粒与感受态细胞混合，冰浴30min；42℃热激90s，冰浴2～3min；然后在LB培养基中37℃摇床振荡培养40～50min，4000rpm离心1min，弃掉上清，重悬菌体沉淀，即得。根据本专利技术优选的，所述步骤(3)中氨苄青霉素的浓度为100μg/mL，筛选条件为：37℃，200rpm培养12～20h。所述步骤(3)中提取重组表达载体用质粒小量提取试剂盒(E.Z.N.APlasmidMiniprepKit，OMEGA)提取质粒，具体步骤见质粒提取试剂盒说明书，提取的质粒测序验证后获得过表达质粒。根据本专利技术优选的，所述步骤(4)中HindIII酶切线性化的体系如下：根据本专利技术优选的，所述步骤(4)中原生质体的制备步骤如下：将木霉SMF2的孢子接种于菌丝生长培养基中，28℃、160rpm培养13h；将菌丝培养物4000rpm离心5min，用0.7MNaCl洗三次，每次25mL，加入细胞壁裂解酶液，重悬，30℃、60rpm酶解2.5～3h，过滤，滤液中加入预冷的浓度为0.7M的NaCl溶液，NaCl溶液加入量为5.7mL，4℃，3800rpm离心5min收集原生质体，收集到的原生质体用20mL预冷的0.7M的STC溶液洗两次后加入600μL预冷的STC溶液重悬，使原生质体浓度为5×107～5×108个/mL；进一步优选的，所述细胞壁裂解酶液按如下方法配制：0.24g细胞壁裂解酶，溶于5.7mL浓度为0.7M的NaCl溶液中，过滤除菌，加入0.3mLpH5.8的PBS缓冲液。进一步优选的，所述STC溶液成分如下：0.7MD-Sorbitol(D-S山梨糖醇)，0.05MCaCl2，10mMTris-HCl，pH7.5。根据本专利技术优选的，所述步骤(4)中的转化原生质体，步骤为：取150μL线性质粒溶液和150μL原生质体混匀加入到100mL离心管底部，冰浴20min后逐滴加入1.5mLPTC溶液，冰浴20min，再室温放置20min；加入STC溶液清洗，4℃，4000rpm离心5min后弃上清。进一步优选的，所述PTC溶液组分如下：600g/LPEG4000(聚乙二醇4000)，10mMTris-HCl，10mMCaCl2，pH7.5；根据本专利技术优选的，所述步骤(4)中再生，步骤为：将转化后的原生质体经液体再生培养基重悬，28℃过夜；然后转接至含100μg/mL潮霉素B的固体再生培养基混匀，28℃培养16h；根据本专利技术优选的，所述步骤(4)中初筛，步骤为：将本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株过表达lae1基因的木霉工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)从木霉SMF2提取基因组DNA，然后以制得的基因组DNA为模板进行PCR扩增，制得lae1基因ORF区及终止子序列；所述lae1基因ORF区及终止子序列的PCR特异引物序列如下：lae1OE‑F：CATGccatggCCTCTCGAAACGCTCCCAAC；lae1OE‑R：CCCaagcttCTAGCTAACCTGTTGCTGTAC；(2)将步骤(1)制得的lae1基因ORF区及终止子序列经NcoI和HindIII双酶切后，与同样经NcoI和HindIII双酶切的载体pIG‑1783进行连接，制得重组质粒；(3)将步骤(2)制得的重组质粒转化E.coliDH5α感受态细胞，经含氨苄青霉素Amp的LB培养基筛选，提取重组表达载体，制得过表达质粒pIG1783‑lae1OE；(4)将步骤(3)制得的过表达质粒pIG1783‑lae1OE经HindIII酶切线性化，然后转化原生质体，经再生、初筛、复筛，制得过表达lae1基因的木霉工程菌。

【技术特征摘要】
1.一株过表达lae1基因的木霉工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)从木霉SMF2提取基因组DNA，然后以制得的基因组DNA为模板进行PCR扩增，制得lae1基因ORF区及终止子序列；所述lae1基因ORF区及终止子序列的PCR特异引物序列如下：lae1OE-F：CATGccatggCCTCTCGAAACGCTCCCAAC；lae1OE-R：CCCaagcttCTAGCTAACCTGTTGCTGTAC；(2)将步骤(1)制得的lae1基因ORF区及终止子序列经NcoI和HindIII双酶切后，与同样经NcoI和HindIII双酶切的载体pIG-1783进行连接，制得重组质粒；(3)将步骤(2)制得的重组质粒转化E.coliDH5α感受态细胞，经含氨苄青霉素Amp的LB培养基筛选，提取重组表达载体，制得过表达质粒pIG1783-lae1OE；(4)将步骤(3)制得的过表达质粒pIG1783-lae1OE经HindIII酶切线性化，然后转化原生质体，经再生、初筛、复筛，制得过表达lae1基因的木霉工程菌。2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中lae1基因ORF区及终止子序列的PCR扩增体系如下，总体系为50μL：所述PCR扩增程序如下：95℃预变性5min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃终延伸5min。3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中NcoI和HindIII双酶切反应体系如下，总体系为20μL：NcoI和HindIII双酶切反应条件为：37℃温浴30min；优选的，所述步骤(2)中的连接采用T4连接酶进行连接，反应条件为：16℃连接过夜。4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中转化E.coliDH5α感受态细胞的步骤如下：取-80℃保存的E.coliDH5α感受态细胞冰浴融化，将重组质粒与感受态细胞混合，冰浴30min；42℃热激90s，冰浴2～3min；然后在LB培养基中37℃摇床振荡培养40～50min，4000rpm离心1min，弃掉上清，重悬菌体沉淀，即得；优选的，所述步骤(3)中氨苄青霉素的浓度为100μg/mL，筛选条件为：37℃，200rpm培养12～20h。5.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(4)中HindIII酶切线性化的体系如下：优选的，所述步骤(4)中原生质体的制备步骤如下：将木霉SMF2的孢子接种于菌丝生长培养基中，28℃、160rpm培养13h；将菌丝培养物4000rpm离心5min，用0.7MNaCl洗三次，每次25mL，加入细胞壁裂解酶液，重悬，30℃、60rpm酶解2.5～3h，过滤，滤液中加入预冷的浓度为0.7M的NaCl溶液，NaCl溶液加入量为5.7mL，4℃，3800rpm离心5min收集原生质体，收集到的原生质体用20mL预冷的0.7M的STC溶液洗两次后加入600μL预冷的STC溶液重悬，使原生质体浓度为5×107～5×108个/mL；进一步优选的，所述细胞壁裂解酶液按如下方法配制：0.24g细胞壁裂解酶，溶于5.7mL浓度为0.7M的NaCl溶液中，过滤除菌，加入0.3mLpH5.8的PBS缓冲液；进一步优选的，所述STC溶液成分如下：...

【专利技术属性】
技术研发人员：张玉忠，宋晓妍，时金超，周燕蓉，刘白雪，陈秀兰，刘巍峰，解彬彬，李平一，李春阳，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37