卵巢癌易感基因变异文库构建方法技术

本发明专利技术涉及一种卵巢癌易感基因变异文库构建方法，包括以下步骤：A.根据卵巢癌相关基因的变异区域，设计能够检测这些变异区域的引物对；B.计算得到各引物对的判断参数R，将判断参数R的值小于或等于1的引物对，归为第一组引物组合液，将判断参数R的值大于1的引物对，归为第二组引物组合液；C.将待测样品DNA抽提纯化；D.分别采用第一组引物组合液和第二组引物组合液对纯化后的样品进行初始PCR扩增；E.对所述目标片段进行接头连接得到带接头片段；F.采用第一组引物组合液和第二组引物组合液的混合液进行文库PCR扩增，得到测序文库。本发明专利技术的卵巢癌易感基因变异文库构建方法所构建的文库测序通量高，灵敏度强，特异性强，能够用于检测游离DNA低频突变的。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种卵巢癌易感基因变异文库构建方法，属于生物

技术介绍
目前肿瘤的发病率和死亡率高于其他疾病，开发以非侵入式诊断策略进行肿瘤基因诊断研发，针对肿瘤靶标与化疗用药后复发、转移与抗药性，而传统疾病诊断通过临床经验、病理监测、细胞检测作为依据，有灵敏度的限制，也无法做到早期发现早期治疗或提早预测提早预防。新一代高通量基因检测技术，当今主要以Illumina公司的Hiseq，Miseq系列和Life公司的IonTorrentTM系列测序仪为代表，有着其他技术不可比拟的高通量、低成本等优势。已被广泛用于各类生物学研究核医学检测。对有参考的物种序列，进行全基因组重测序，在全基因组水平上检测突变位点，发现个体差异的分子基础。新一代测序技术通过全基因组测序构建了大量常规物种的基因组图谱，也促进了测序技术的告诉发展。同时，高通量测序技术在基因诊断和基因治疗方面也有着重要的作用。SNPs(单核苷酸多态性)指在不同个体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大多数核苷酸序列一直，而只有一个碱基不同的现象。SNP是人类DNA中常见的变异形式，数以百万存在整个人类的基因组中，部分SNP能够导致蛋白质氨基酸编码改变或基因表达调控改变。卵巢癌发病率占女性生殖器官恶性肿瘤的第三位，仅次于宫颈癌和子宫内膜癌，目前已跃居我国女性恶性肿瘤之首或第二位，其主要缘于缺乏早期症状或有效筛查。卵巢癌的早期检测使5年存活率从低于30％增加至70％～90％，但早期确诊病例低于20％。卵巢癌易感基因是与卵巢癌的发生具有紧密关联的基因。大量研究证实遗传因素在疾病的易感性中发挥重要作用，复杂疾病的遗传因素己证实存在微效基因剂量效应，即微效基因作用的累加才可以形成明显的表型综合效应。因此，对疾病的多个易感基因及突变位点进行检测至关重要，约占整个基因组中遗传突变的92％。对卵巢癌的易感基因的研究并不需要对全基因组测序，而只需要对特定的几个基因进行研究。这项技术首先合成大量能与基因组特定区域互补结合的寡核苷酸序列，通过PCR扩增富集目标区段，然后用高通量测序技术对这些区段进行测序。目前，检测卵巢癌易感基因的常见方法是Sanger测序法和基因芯片法，Sanger测序法能对卵巢癌易感基因进行区域检测，但Sanger测序法每次只能对一个样品的某一段区域进行测序，因此检测效率低、成本高。而且由于sanger测序原理的限制，在检测带有杂合子的样品信号时会出现双峰乃至多峰，使得该样品无法准确识别出来，导致检测灵敏度低(20％)。基因芯片法，该方法只能针对一个或数个已知突变的位点设计检测探针形成检测芯片，因此无法用于检测未知突变位点，检测的结果也就不够全面、准确。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种测序通量高，灵敏度强，特异性强，基于二代测序平台技术，能够用于检测游离DNA低频突变的卵巢癌易感基因变异文库构建方法。本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种卵巢癌易感基因变异文库构建方法，包括以下步骤：A.根据卵巢癌相关基因的变异区域，设计能够检测这些变异区域的引物对；B.通过引物设计软件得到各引物对的参数W1、Tm1、W2和Tm2，从而计算得到各引物对的判断参数R，计算公式如下：R＝0.1×[W1+Tm1/(Tm1+Tm2)]+0.9×[W2+Tm2/(Tm1+Tm2)]；其中，W1是扩增产物的GC含量，Tm1是扩增产物的退火温度，W2是上游引物GC含量和下游引物GC含量的平均值，Tm2是上游引物退火温度和下游引物退火温度的平均值，将判断参数R的值小于或等于1的引物对，归为第一组引物组合液，将判断参数R的值大于1的引物对，归为第二组引物组合液；C.将待测样品DNA抽提纯化；D.分别采用第一组引物组合液和第二组引物组合液对纯化后的样品进行初始PCR扩增得到目标片段，然后清除引物，采用第一组引物组合液进行初始PCR扩增时的退火温度低于采用第二组引物组合液进行初始PCR扩增时的退火温度；E.对所述目标片段进行接头连接得到带接头片段，然后进行纯化；F.采用第一组引物组合液和第二组引物组合液的混合液对纯化后的带接头片段进行文库PCR扩增，然后进行纯化，得到测序文库。上述卵巢癌相关基因包括ATM、BARD1、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDH1、CHEK2、EPCAM、MLH1、MRE11、MSH2、MSH6、MUTYH、NBN、NF1、PALB2、PMS2、PTEN、RAD50、RAD51C、RAD51D、STK11、TP53、MTHFR、HSPB1、CYP1B1中的一种或多种。上述引物对所覆盖的变异区域包括chr17：58692662-58692788、chr17：58695139-58695189、chr17：58696693-58696757、chr17：58709872-58709987、chr17：58720748-58720811、chr11:108235723-108235773、chr11:108247101-108247109、chr11:108250805-108250828、chr11:108330374-108330408、chr2:214730424-214730455、chr2:214745751-214745803、chr2:214780922-214780935、chr2:214809412-214809443、chr17：43082440-43082543、chr17：43092005-43092100、chr17：43092907-43092953、chr17：43093990-43094074、chr17：43106475-43106492、chr17：43115753-43115774、chr13：32326505-32326575、chr13：32332322-32332386、chr13：32332536-32332638、chr13：32333139-32333219、chr13：32336459-32336562、chr13：32337435-32337471、chr13：32363206-32363316、chr13：32398684-32398766、chr17:7669616-7669662、chr17:7673736-7673788、chr17:7673736-7673788、chr17:7673736-7673831、chr17:7674183-7674253、chr17:7675053-7675108、chr17:7676214-7676245、chr16：68808708-68808772、chr16：6881687-68818751、chr16：68808708-68808772、chr16：68819374-68819424、chr16：68808708-68808772、chr22：28694055-28694109、chr22：28696891-28696981、chr22：28695721-28695804、ch2:47373517-47373532、ch2:47373921-47373956、ch2:47378954-47378980、chr3:3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种卵巢癌易感基因变异文库构建方法，其特征在于，包括以下步骤：A.根据卵巢癌相关基因的变异区域，设计能够检测这些变异区域的引物对；B.通过引物设计软件得到各引物对的参数W1、Tm1、W2和Tm2，从而计算得到各引物对的判断参数R，计算公式如下：R=0.1×[W1+Tm1/(Tm1+Tm2)]+0.9×[W2+Tm2/(Tm1+Tm2)]；其中，W1是扩增产物的GC含量，Tm1是扩增产物的退火温度，W2是上游引物GC含量和下游引物GC含量的平均值，Tm2是上游引物退火温度和下游引物退火温度的平均值，将判断参数R的值小于或等于1的引物对，归为第一组引物组合液，将判断参数R的值大于1的引物对，归为第二组引物组合液；C.将待测样品DNA抽提纯化；D.分别采用第一组引物组合液和第二组引物组合液对纯化后的样品进行初始PCR扩增得到目标片段，然后清除引物，采用第一组引物组合液进行初始PCR扩增时的退火温度低于采用第二组引物组合液进行初始PCR扩增时的退火温度；E.对所述目标片段进行接头连接得到带接头片段，然后进行纯化；F.采用第一组引物组合液和第二组引物组合液的混合液对纯化后的带接头片段进行文库PCR扩增，然后进行纯化，得到测序文库。...

【技术特征摘要】
1.一种卵巢癌易感基因变异文库构建方法，其特征在于，包括以下步骤：A.根据卵巢癌相关基因的变异区域，设计能够检测这些变异区域的引物对；B.通过引物设计软件得到各引物对的参数W1、Tm1、W2和Tm2，从而计算得到各引物对的判断参数R，计算公式如下：R=0.1×[W1+Tm1/(Tm1+Tm2)]+0.9×[W2+Tm2/(Tm1+Tm2)]；其中，W1是扩增产物的GC含量，Tm1是扩增产物的退火温度，W2是上游引物GC含量和下游引物GC含量的平均值，Tm2是上游引物退火温度和下游引物退火温度的平均值，将判断参数R的值小于或等于1的引物对，归为第一组引物组合液，将判断参数R的值大于1的引物对，归为第二组引物组合液；C.将待测样品DNA抽提纯化；D.分别采用第一组引物组合液和第二组引物组合液对纯化后的样品进行初始PCR扩增得到目标片段，然后清除引物，采用第一组引物组合液进行初始PCR扩增时的退火温度低于采用第二组引物组合液进行初始PCR扩增时的退火温度；E.对所述目标片段进行接头连接得到带接头片段，然后进行纯化；F.采用第一组引物组合液和第二组引物组合液的混合液对纯化后的带接头片段进行文库PCR扩增，然后进行纯化，得到测序文库。2.根据权利要求1所述的卵巢癌易感基因变异文库构建方法，其特征在于：所述卵巢癌相关基因包括ATM、BARD1、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDH1、CHEK2、EPCAM、MLH1、MRE11、MSH2、MSH6、MUTYH、NBN、NF1、PALB2、PMS2、PTEN、RAD50、RAD51C、RAD51D、STK11、TP53、MTHFR、HSPB1、CYP1B1中的一种或多种。3.根据权利要求1所述的卵巢癌易感基因变异文库构建方法，其特征在于：所述引物对所覆盖的变异区域包括chr11:108235723-108235773、chr11:108247101-108247109、chr11:108250805-108250828、chr11:108330374-108330408、chr2:214730424-214730455、chr2:214745751-214745803、chr2:214780922-214780935、chr2:214809412-214809443、chr17：43082440-43082543、chr17：43092005-43092100、chr17：43092907-43092953、chr17：43093990-43094074、chr17：43106475-43106492、chr17：43115753-43115774、chr13：32326505-32326575、chr13：32332322-32332386、chr13：32332536-32332638、chr13：32333139-32333219、chr13：32336459-32336562、chr13：32337435-32337471、chr13：32363206-32363316、chr13：32398684-32398766、chr17:7669616-7669662、chr17:7673736-7673788、chr17:7673736-7673788、chr17:7673736-7673831、chr17:7674183-7674253、chr17:7675053-7675108、chr17:7676214-7676245、chr16：68808708-68808772、chr16：6881687-68818751、chr16：68808708-68808772、chr16：68819374-68819424、chr16：68808708-68808772、chr22：28694055-28694109、chr22：28696891-28696981、chr22：28695721-28695804、ch2:47373517-47373532、ch2:47373921-47373956、ch2:47378954-47378980、chr3:37020368-37020459、chr3:37028815-37028859、chr3:37048982-37049005、chr11:94445816-94445870、chr11:94445816-94445870、chr11:94460995-94461029、chr2:47403286-47403289、chr2:47412447-47412470、chr2:47445572-47445651、chr2:47482870-47482922、chr2:47795926-4779...

【专利技术属性】
技术研发人员：王明，赵会，
申请(专利权)人：上海赛安生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31