一种组合物、含有该组合物的诱导制剂及诱导方法技术

本发明专利技术涉及细胞领域，特别涉及一种组合物、含有该组合物的诱导制剂及诱导方法。该组合物包括5‑氮杂胞苷、骨成形蛋白和血管紧张素II。还提供了一种诱导制剂，所述诱导制剂中所述5‑氮杂胞苷的终浓度为5～15μmol/L，所述骨成形蛋白的终浓度为5～15μg/L，所述血管紧张素II的终浓度为1～10μmol/L。本发明专利技术提供一种有效的GMSCs成心肌样细胞的诱导方法。其中诱导分化培养液成分包括10％FBS、10μmol/L 5‑aza、10ng/mL BMP‑2、5μmol/L Ang‑II的DMEM/F12培养基。该方法能够有效地诱导GMSCs向心肌样细胞分化。GMSCs自体取材方便、易于体外扩增，可以用于自体移植,从而避免了免疫排斥反应。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞领域，特别涉及一种组合物、含有该组合物的诱导制剂及诱导方法。
技术介绍
心肌梗死是由于冠状动脉循环改变引起冠脉血流和心肌需求之间不平衡而导致的心肌损坏,是临床上一种严重的缺血性心脏病。坏死后的心肌细胞逐渐被瘫痕组织所取代，由于瘫痕组织缺乏弹性，难以满足心脏收舒功能的要求,为代偿损失心肌细胞的功能，心脏逐渐发生退行性左心室重塑，心功能下降，最终导致充血性心力衰竭，甚至猝死。临床药物和介入治疗虽可以改善症状，但却不能挽回受损的心肌细胞。心脏移植虽可以从根本上解决心室重构问题,但因为其供体受限，医疗费用太高而难以广泛应用。近年来的研究表明，心肌细胞也具有再生能力，在心肌梗死后，心肌细胞也可以发生分裂和增值，但是，由于其增值能力较弱，不能满足弥补丧失心肌细胞数量的要求而逆转心室重构过程。近年来随着干细胞技术和组织工程学研究的不断深入，干细胞移植治疗心肌梗死成为临床研究的热点。干细胞的多向分化潜能及可塑性使心肌梗死心肌细胞再生成为可能，在人体的微环境作用下，干细胞定向归巢至损伤处，可以多项分化成各种组织细胞及血管。目前用于心肌梗死治疗研究的干细胞主要有骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞、脐带间充质干细胞、脂肪干细胞等。牙龈属于牙周组织，是附于牙齿周围的分隔下方牙周组织和外部空间的粘膜屏障。牙龈包括上皮和固有层两部分，从发育来源上，上皮来自原始口腔上皮，与口腔粘膜上皮相延续；固有层则发育自早期神经嵴细胞迁移形成的间充质，上皮与间充质不断相互作用，最终形成牙龈组织。牙龈组织的一个典型特点是具有较强的创伤愈合能力，表现为切除、损伤后能够无疤愈合，恢复牙龈外形。牙龈间充质干细胞(gingivalmesenchymalstemcells,GMSCs)是组成牙龈结缔组织的主要间充质细胞,来源于中胚层的纤维母细胞，不仅具有活跃的自我更新的能力，并且还具有合成和降解胶原等细胞外基质的功能：I型和Ⅲ型胶原、纤维粘连蛋白等。牙龈间充质干细胞取材方便、牙龈组织中细胞含量大、增值速度快,作为成体间充质干细胞中的一员，在体外使用合适的诱导剂同样具有分化为心肌样细胞的能力。牙龈间充质干细胞这种功能特性极大地吸引了来自基础医学和临床医学的研究者，给基础科学的研究者们提供了一种研究发展生物学的模式，牙龈间充质干细胞所具有的修复、替代和再生能力也为临床医学提供了一个发展新疗法的机会。目前对于GMSCs向心肌样细胞分化诱导的研究报道尚少。由于生物体是一个复杂的存在多诱导因素的有机体，因此在心肌组织再生的复杂微环境中，多种诱导因子在心肌组织再生的过程中可能会起到相互协同或拮抗的作用。因此，提供一种由两种诱导因子联合应用作用于GMSCs，有效的诱导GMSCs向心肌样细胞分化具有重要的现实意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供一种组合物、含有该组合物的诱导制剂及诱导方法。该组合物能够有效地诱导GMSCs向心肌样细胞分化为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种组合物，包括5-氮杂胞苷、骨成形蛋白和血管紧张素II。5-氮杂胞苷(5-azacytidine，5-aza)是一种可改变基因的去甲基化药物,作为一种诱导剂常用于体外实验研究。5-aza是胞苷类似物，为DNA甲基转移酶抑制剂，当其作用于MSC时能整合进入DNA中，通过抑制DNA甲基转移酶使低DNA甲基化，而DNA的甲基化程度和基因调节密切相关。5-aza诱导MSC心肌化,可能是它和控制向心肌分化的特异启动子基因上阻遏蛋白结合，使其去甲基化而发生构型改变，从而启动细胞向心肌分化，使转变成心肌细胞。骨成形蛋白(BMP)是一个至少包括20个成员的家族，属于TGF-β超家族的一员。骨形态发生蛋白具有多种生物学功能，参与胚胎时期骨组织的发育，成年骨缺损修复及机体某些骨疾病的发生过程，并且在脂肪、肾脏、骨骼、肝脏及神经系统发育中起一定作用。近年来的研究发现,骨形态发生蛋白参与调节某些心脏转录因子的表达，对心肌干细胞的定向分化起重要作用。尤其是BMP-2，在胚胎心脏的发生以及干细胞向心肌分化方面发挥重要作用。血管紧张素II(AngiontensinII，Ang-II)是人体内正常存在的一种多肽类激素类物质，在心血管疾病的发生发展以及血管重塑中起到一定的作用。有研究显示人类脂肪来源间充质干细胞经Ang-II诱导之后表达平滑肌特异性基因增加，其向平滑肌样细胞分化，而且还可以诱导间充质干细胞血管内皮生长因子合成增加，也可诱导多能干细胞向中胚层前体细胞分化和增殖。Ang-II单独可以促使间充质干细胞向心肌样细胞分化，同时使用5-aza可以进一步提高增殖和分化的效率。本专利技术还提供了所述组合物在诱导牙龈间充质干细胞向心肌样细胞分化中的应用。本专利技术还提供了一种诱导制剂，包括本专利技术提供的组合物。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述诱导制剂中所述5-氮杂胞苷的终浓度为5～15μmol/L。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述诱导制剂中所述骨成形蛋白的终浓度为5～15μg/L。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述诱导制剂中所述血管紧张素II的终浓度为1～10μmol/L。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述诱导制剂还包括细胞培养基。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述诱导制剂还包括血清。此外，本专利技术还提供了所述的诱导制剂在诱导牙龈间充质干细胞向心肌样细胞分化中的应用。本专利技术还提供了一种牙龈间充质干细胞分化为心肌样细胞的诱导方法，取牙龈间充质干细胞与本专利技术提供的诱导制剂混合后培养。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述牙龈间充质干细胞的制备方法包括如下步骤：1、GMSCs原代分离培养：1)原材料来源：取临床上正畸导萌术切下的牙龈或阻生拔牙需要而切除包绕在恒牙周围的牙龈组织。要求患者没有牙龈增生、炎症及使用过导致牙龈增生的药物。切取的牙龈组织快速浸入含3倍双抗的4℃预冷的PBS中。其中，3倍双抗浓度为300u/mL青霉素、300u/mL链霉素。2)漂洗：用含3倍双抗的PBS冲洗3次，再将牙龈置于间充质干细胞无血清培养基中浸泡5min；其中，3倍双抗浓度为300u/mL青霉素、300u/mL链霉素。其中，间充质干细胞无血清培养基中含有100u/mL青霉素、100u/mL链霉素。3)第一次消化：将牙龈组织剪成1cm3大小，加入适量Ⅰ型胶原酶-Dispase酶混合消化液，置37℃，200R恒温摇床中消化45min。消化结束后，1000r/min离心5min，弃上清。加入适量PBS重悬，100um细胞滤网过滤悬液，过滤后的细胞悬液1000r/min离心5min，弃上清。其中，Ⅰ型胶原酶-Dispase酶的比例为1:1，胶原酶浓度为胶原酶3g/L，Dispase酶浓度为Dispase酶4g/L。其中，消化环境为为37℃，200R恒温摇床中，消化时间为45min；其中，所用细胞滤网孔径为100um；其中，离心速度为1000r/min，离心时间为5min。4)第二次消化：把步骤3)中过滤下下来未消化的组织加入等体积的0.125％的胰蛋白酶，置37℃，200R恒温摇床中继续消化15min。消化结束后，1000r/min离心5min，弃上清。加入适量PBS重悬，70um细胞滤网过滤悬液，过滤后的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种组合物，其特征在于，包括5‑氮杂胞苷、骨成形蛋白和血管紧张素II。

【技术特征摘要】
1.一种组合物，其特征在于，包括5-氮杂胞苷、骨成形蛋白和血管紧张素II。2.根据权利要求1所述的组合物在诱导牙龈间充质干细胞向心肌样细胞分化中的应用。3.一种诱导制剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的组合物。4.根据权利要求3所述的诱导制剂，其特征在于，所述5-氮杂胞苷的终浓度为5～15μmol/L。5.根据权利要求3或4所述的诱导制剂，其特征在于，所述骨成形蛋白的终浓度为5～15μg/L。6.根据权利要求3至5任一项所述的诱...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛啸虎，陈海佳，王一飞，戚康艺，
申请(专利权)人：广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44