骨骼肌干细胞无血清培养基及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了骨骼肌干细胞无血清培养基及其制备方法和应用。所述培养基包含以下各成分：DMEM：F12、血清替代物、细胞因子、维生素、氨基酸、人重组胰岛素、助壮素和6‑硫酸软骨素；该培养基的pH值为7.2～7.4。本发明专利技术进一步公开了制备所述骨骼肌干细胞无血清培养基的方法。本发明专利技术血清替代物为无动物源成分，成份确定，避免了血清带来的致病风险，批次不稳定等因素，本发明专利技术培养基适用于人骨骼肌干细胞原代及规模化扩增培养，具有纯度高，细胞增殖快，扩增效率高，可稳定传代20代以上等优点。本发明专利技术有效提高了骨骼肌干细胞扩增效率及纯度，能够作为规模化的、优质的骨骼肌干细胞培养体系以满足临床研究及应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种细胞培养基，尤其涉及一种人骨骼肌干细胞无血清培养基，本专利技术进一步涉及人骨骼肌干细胞无血清培养基的制备方法以及在培养人骨骼肌干细胞中的应用，属于人骨骼肌干细胞的培养基领域。
技术介绍
骨骼肌干细胞(又名成肌细胞，肌母细胞，英文名称：myoblast)只能定向分化为肌肉组织，以骨骼肌卫星细胞的形式存在骨骼肌组织中，具有天然的细胞融合，在肌肉受到损伤后，骨骼肌干细胞被激活，大量增殖并产生收缩蛋白，修复和维持骨骼肌组织。骨骼肌干细胞移植技术在治疗肌萎缩、心脏病、糖尿病、肿瘤、疼痛、抑郁症、骨关节疾病方面近年来被国内外连续报道，骨骼肌干细胞移植技术作为一种新型疾病解决方案越来越受到全世界的关注。Gussoni等采用双盲对照法治疗8例DMD患者,证明骨骼肌干细胞移植对DMD患者有一定的疗效。目前全球20个国家230例病人的临床研究表明，给心肌梗死患者注射人骨骼肌干细胞后可改善梗死病灶周围局部心肌功能，增加左室射血分数，灌注，生存能力，动力，壁厚，以及舒张末期和收缩末期的血容量，不伴有心律失常。这种治疗手段将可能成为治疗心肌梗死和心力衰竭最重要的新途径。骨骼肌干细胞移植用于治疗II型糖尿病也已经展开。所有以上的这些治疗效果很大程度上依赖细胞移植量，据相关报道，骨骼肌干细胞治疗心脏病，心肌梗塞等心肌病使用的细胞数量为2×109，治疗DMD患者使用的数量为5×1010。所以，探索一种能够高纯度、规模化扩增骨骼肌干细胞并应用于临床的培养体系已迫在眉睫。目前，大多数研究机构均以DMEM：F12/1:1，α-MEM等基础培养基添加10％-20％的胎牛血清来培养骨骼肌干细胞。但胎牛血清培养基含动物源成分，成分不确定、存在风险且血清的批间差异大、不易于控制，骨骼肌干细胞难以纯化、扩增效率低成为了临床应用上难以逾越的难点。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对骨骼干细胞培养基添加胎牛血清，含有动物源成分，导致骨骼肌干细胞难以纯化、扩增效率低等问题，提供了一种优化的骨骼肌干细胞无血清培养基，用于人骨骼肌干细胞原代培养及规模化扩增培养，为临床研究及应用提供优质的骨骼肌干细胞。本专利技术所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：一种骨骼肌干细胞无血清培养基，包含以下各成分：DMEM和F12按照1:1的质量比组成的混合物，血清替代物，细胞因子，维生素，氨基酸，人重组胰岛素，转铁蛋白，L-谷氨酸酰胺，盐酸硫胺素，肌醇，尼克酰胺，胆固醇，P68，吐温80，柠檬酸铁铵和NaHCO3；pH值为7.2～7.4。所述血清替代物为UltroserG血淸替代物；所述细胞因子为胰岛素样生长因子，表皮细胞生长因子或碱性成纤维生长因子中的任何一种或多种；所述的维生素是维生素C、维生素B1或维生素B6中的任何一种或二者的组合。所述氨基酸为1水L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯基丙氨酸、L-丝氨酸、L-色氨酸、L-半胱氨酸、L-鸟氨酸盐酸或对氨基苯甲酸中的任何一种或多种。为了达到更好的效果，每升培养基中，各成分的含量为：DMEM：F12含量为15.6g/L，其中，DMEM：F12的质量比例为1:1；所述血清替代物含量为20mL/L；所述维生素B6含量为0.95～1.05mg/L，优选为0.975mg/L；所述维生素B1含量为1.0～1.03mg/L，优选为1.03mg/L；所述维生素C含量为6～6.9mg/L，优选为6.45mg/L；所述胰岛素样生长因子含量为80～100μg/L，优选为100μg/L；表皮细胞生长因子含量为18～22μg/L，优选为20μg/L；碱性成纤维生长因子含量为18～22μg/L，优选为20μg/L；所述人重组胰岛素含量为0.01～0.02mg/L，优选为0.02mg/L；所述1水L-天冬酰胺含量为48.45～53.25mg/L，优选为51.25mg/L；L-天冬氨酸含量为30.35～31.35mg/L，优选为30.75mg/L；L-组氨酸含量为85.12～89.12mg/L，优选为87.12mg/L；L-异亮氨酸含量为38.55～42.13mg/L，优选为41.13mg/L；L-亮氨酸含量为33.55～36.55mg/L，优选为34.55mg/L；L-赖氨酸含量为165.44～172.44mg/L，优选为168.44mg/L；L-蛋氨酸含量为4.9～5.1mg/L，优选为5.0mg/L；L-苯基丙氨酸含量为21～23mg/L，优选为22mg/L；L-丝氨酸含量为38.5～40.35mg/L，优选为39.5mg/L；L-色氨酸含量为12.3～14.46mg/L，优选为13.6mg/L；L-半胱氨酸含量为108.7～115.3mg/L，优选为113.7mg/L；L-鸟氨酸盐酸含量为27.3～30.3mg/L，优选为29.3mg/L、对氨基苯甲酸含量为1.0～1.03mg/L，优选为1.03mg/L；所述转铁蛋白含量为11.5～12.5mg/L，优选为12.5mg/L；L-谷氨酸酰胺含量为0.2mM；盐酸硫胺素含量为1.0～1.03mg/L，优选为1.03mg/L，肌醇含量为34.5～37.01mg/L，优选为35.51mg/L；尼克酰胺含量为1.0～1.03mg/L，优选为1.03mg/L；胆固醇含量为0.015～0.019mg/L，优选为0.019mg/L；普朗尼克F68含量为97～100mg/L，优选为98mg/L；吐温80含量为5.1～5.4mg/L，优选为5.25mg/L；柠檬酸铁铵含量为179.1～186.6mg/L，优选为181.6mg/L；NaHCO3含量为1.2g/L。本专利技术发现，在上述培养基中添加6-硫酸软骨素时对骨骼肌干细胞的增殖活性均有一定的促进作用；优选的，6-硫酸软骨素的添加量为50-500mg/L，其中，6-硫酸软骨素的添加量为200μg/ml附近，骨骼肌干细胞增殖活性达到最优。本专利技术进一步发现，向上述骨骼肌干细胞无血清培养基中添加一定用量的助壮素(N,N-二甲基哌啶氯化物)能够有效促进骨骼肌干细胞的生长，其中，助壮素的添加量为8.7～10.7mg/L时能够明显促进骨骼肌干细胞的生长，助壮素的添加量为9.0mg/L时能够显著促进骨骼肌干细胞的生长，骨骼肌干细胞增殖活性达到最高，大于此浓度时，骨骼肌干细胞增殖活性呈现平稳趋势，表明9.0mg/L的浓度为最佳添加剂量。本专利技术中的μg/L、mg/L和g/L均为基于每升培养基所述成分的重量，mL/L是基于每升培养基所述成分的体积，mM是基于每升培养基所述成分的摩尔数。本专利技术进一步提供了一种制备人骨骼肌干细胞无血清培养基的方法，该培养基由以下步骤制得：(1)将DMEM:F12(1:1)的干粉溶解在注射用水中得到基础培养基；(2)将其余的各它成分加入到基础培养基中，搅拌至完全溶解；(3)调节pH值至7.2～7.4，Osmo检测范围290-320mOsm/kg；(4)用0.22μm滤膜过滤除菌，即得。本专利技术骨骼肌干细胞无血清培养基中的血清替代物为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种骨骼肌干细胞无血清培养基，其特征在于，包含以下各成分：DMEM：F12，血清替代物，细胞因子，维生素，氨基酸，人重组胰岛素、转铁蛋白，L‑谷氨酸酰胺，盐酸硫胺素，肌醇，尼克酰胺，胆固醇，普朗尼克F68，吐温80，柠檬酸铁铵和NaHCO3；该培养基的pH值为7.2～7.4。

【技术特征摘要】
1.一种骨骼肌干细胞无血清培养基，其特征在于，包含以下各成分：DMEM：F12，血清替代物，细胞因子，维生素，氨基酸，人重组胰岛素、转铁蛋白，L-谷氨酸酰胺，盐酸硫胺素，肌醇，尼克酰胺，胆固醇，普朗尼克F68，吐温80，柠檬酸铁铵和NaHCO3；该培养基的pH值为7.2～7.4。2.按照权利要求1所述的骨骼肌干细胞无血清培养基，其特征在于，所述血清替代物为UltroserG血淸替代物；所述细胞因子为胰岛素样生长因子，表皮细胞生长因子或碱性成纤维生长因子中的任何一种或多种；所述的维生素是维生素C、维生素B1或维生素B6中的任何一种或二者的组合；所述氨基酸为1水L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯基丙氨酸、L-丝氨酸、L-色氨酸、L-半胱氨酸、L-鸟氨酸盐酸或对氨基苯甲酸中任何一种或一种以上的任意组合；所述普朗尼克F68主要是聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物。3.按照权利要求1或2所述的骨骼肌干细胞无血清培养基，其特征在于，每升培养基中，各成分的含量为：DMEM：F12含量为15.6g/L，其中，DMEM：F12的质量比例为1:1；所述血清替代物含量为20mL/L；所述维生素B6含量为0.95～1.05mg/L，优选为0.975mg/L；所述维生素B1含量为1.0～1.03mg/L，优选为1.03mg/L；所述维生素C含量为6～6.9mg/L，优选为6.45mg/L；所述胰岛素样生长因子含量为80～100μg/L，优选为100μg/L；表皮细胞生长因子含量为18～22μg/L，优选为20μg/L；碱性成纤维生长因子含量为18～22μg/L，优选为20μg/L；所述人重组胰岛素含量为0.01～0.02mg/L，优选为0.02mg/L；所述1水L-天冬酰胺含量为48.45～53.25mg/L，优选为51.25mg/L；L-天冬氨酸含量为30.35～31.35mg/L，优选为30.75mg/L；L-组氨酸含量为85.12～89.12mg/L，优选为87.12mg/L；L-异亮氨酸含量为38.55～42.13mg/L，优选为41.13mg/L；L-亮氨酸含量为33.55～36.55mg/L，优选为34.55mg/L；L-赖氨酸含量为165.44～172.44mg/L，优选为168.44mg/L；L-蛋氨酸含量为4.9～5.1mg/L，优选为5.0mg/L；L-苯基丙氨酸含...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘谋元，刘麟，
申请(专利权)人：北京欣博睿丰医疗科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11