高致病性副溶血弧菌快速检测引物及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了高致病性副溶血弧菌快速检测引物及试剂盒，高致病性副溶血弧菌快速检测引物，是由外引物和内引物组成，所述外引物由SEQ ID NO.1所示的外引物上游引物和SEQ ID NO.2所示的外引物下游引物组成；所述内引物由SEQ ID NO.3所示的内引物上游引物和SEQ ID NO.4所示的内引物下游引物组成。本发明专利技术解决了现有技术检测高致病性副溶血弧菌周期长、检测成本高、不能应用于现场检测等问题，使检测过程能够快速有序进行，2h内即可完成所有检测操作，实现了检测过程的程序化和标准化，操作规范，不易出错，对鱼体损伤小。本发明专利技术的引物能有效检测高致病性副溶血弧菌，具有很好的特异性和准确性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种高致病性副溶血弧菌快速检测引物及试剂盒，属于水产病原菌快速检测领域。
技术介绍
我国是全球对虾养殖产量第一大国，2012年产量为165万吨，占全球养殖产量的40％，2013年对虾急性肝胰腺坏死病导致全球养殖对虾减产23％，泰国减产54％，我国减产17％，广东减产30％，养殖时间超过80天池塘的对虾急性肝胰腺坏死病发生率超过了80％，年直接经济损失超过50亿元。近两年该病更加严重。急性肝胰腺坏死病的主要致病菌为一种特异性的副溶血弧菌，该菌的致病性与质粒上编码的PirA和PirB毒素有关。目前对于虾类高致病性副溶血弧菌的检测，主要采用传统的细菌分离鉴定，血清学反应及PCR检测技术，传统的细菌分离鉴定耗时长，操作复杂，而且不能将该特异的副溶血弧菌和传统的副溶血弧菌分离开，而PCR方法能准确鉴定特异性副溶血弧菌，但成本高，需要专业的仪器设备和技术人员，养殖生产中亟需一种能够应用于养殖现场的、快速准确、操作简便的高致病性副溶血弧菌检测技术及其产品。LAMP技术是由Notomi等于2000年首次建立的体外链置换核酸扩增的方法，近年来被广泛研究、应用。它利用靶序列上6个关联区域设计的4条特异引物和1种高活性链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)，在等温条件(60～65℃)放置30～60min即可完成核酸扩增反应，反应液中加入核酸染料SYBRGreenI或钙黄绿素，若有核酸扩增即可显示颜色反应，即时得到检测结果。>该技术具有快速高效、灵敏度高、特异性强、产物易检测、操作简单等优点。目前尚未有关于高致病性副溶血弧菌LAMP检测技术的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种高致病性副溶血弧菌快速检测引物。本专利技术的第二个目的是提供能应用于现场检测的高致病性副溶血弧菌快速检测试剂盒。本专利技术的技术方案概述如下：高致病性副溶血弧菌快速检测引物，由外引物和内引物组成，所述外引物由SEQIDNO.1所示的外引物上游引物和SEQIDNO.2所示的外引物下游引物组成；所述内引物由SEQIDNO.3所示的内引物上游引物和SEQIDNO.4所示的内引物下游引物组成。高致病性副溶血弧菌快速检测试剂盒，包括：(1)TE缓冲液，其组成为20mmol/LTris-HCl，2mmol/LEDTA，溶剂是蒸馏水，pH＝8.0；(2)BstDNA聚合酶：浓度为8U/μl的BstDNA聚合酶；(3)LAMP反应液，每24μlLAMP反应液的组成为：2.5μl10×反应缓冲液；3μl浓度为2.5mmol/L的dNTP；1μl浓度为5μmol/L的由SEQIDNO.1所示的外引物上游引物，1μl浓度为5μmol/L的由SEQIDNO.2所示的外引物下游引物，1μl浓度为40μmol/L的由SEQIDNO.3所示的内引物上游引物，1μl浓度为40μmol/L的由SEQIDNO.4所示的内引物下游引物；1μl钙黄绿素与锰离子形成的配合物、13.5μlDEPC水；(4)阳性对照膜片，用下述方法制成：吸取高致病性副溶血弧菌培养液将FTA膜片充分润湿后室温干燥，放入盛有200μlTE缓冲液的洗涤管中震荡洗涤1次，每次2min，充分干燥；(5)阴性对照膜片，用下述方法制成：吸取DEPC水将FTA膜片充分润湿后室温干燥，放入盛有200μlTE缓冲液的洗涤管震荡洗涤1次，每次2min，充分干燥；(6)无菌封装的FTA膜片、研磨棒、吸管，采集管，洗涤管，检测管。本专利技术的优点：(1)本专利技术解决了现有技术检测高致病性副溶血弧菌周期长、检测成本高、不能应用于现场检测等问题，使检测过程能够快速有序进行，2h内即可完成所有检测操作，实现了检测过程的程序化和标准化，操作规范，不易出错，对鱼体损伤小。(2)本专利技术依据高致病性副溶血弧菌基因所设计的扩增引物能有效检测高致病性副溶血弧菌，具有很好的特异性和准确性。(3)采用内置染料的方法，反应结束后不用打开反应管，取出后直接肉眼观察结果，避免了被扩增产物污染后续待检样品，提高了该试剂盒的应用可靠性。(4)基于对取样方法的改进，不经过细菌培养，仅需取少量南美白对虾的鳃或肝胰腺样品即可进行检测。附图说明图1为高致病性副溶血弧菌快速检测试剂盒检测结果示意图。图2为高致病性副溶血弧菌快速检测试剂盒实际应用检测结果图。图3为高致病性副溶血弧菌快速检测试剂盒灵敏性检测结果图。图4为高致病性副溶血弧菌快速检测试剂盒特异性检测结果图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明，下面的实施例并不限制本专利技术，本领域的专业人员按照本专利技术的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本专利技术的范围内。本专利技术所用仪器及试剂：电热恒温水浴锅购自北京三二八科学仪器有限公司；BstDNA聚合酶、10×反应缓冲液、dNTP购自NEB公司；引物SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4均由上海生工生物工程有限公司合成；DEPC水、Tris购自上海生工生物工程有限公司((DEPC，(diethylpyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)；钙黄绿素购自SIGMA公司；FTA膜片购自通用电气医疗公司(GEhealthcare)；EDTA、硫酸锰为国产分析纯。钙黄绿素与锰离子形成的配合物配比为0.05mmol/L钙黄绿素和0.6mmol/L锰离子。高致病性副溶血弧菌基因组DNA采用商业化的DNA抽提试剂盒(天根的快速DNA提取检测试剂盒KG203)从纯培养的高致病性副溶血弧菌菌液中提取。高致病性副溶血弧菌是从患病南美白对虾鳃、肝胰腺中提取，经形态学、生化特性分析及以16SrDNA为遗传标记的系统发育分析鉴定为高致病性副溶血弧菌。本专利技术可用于检测南美白对虾鳃、肝胰腺是否感染高致病性副溶血弧菌，也可用于检测水体中是否含有高致病性副溶血弧菌或某菌液是否为高致病性副溶血弧菌。本专利技术所指高致病性副溶血弧菌是质粒上编码了PirA和PirB毒素的菌。实施例1高致病性副溶血弧菌快速检测引物，是由外引物和内引物组成，外引物由SEQIDNO.1所示的外引物上游引物和SEQIDNO.2所示的外引物下游引物组成；内引物由SEQIDNO.3所示的内引物上游引物和SEQIDNO.4所示的内引物下游引物组成。实施例2高致病性副溶血弧菌快速检测试剂盒，包括：(1)TE缓冲液，其组成为20mmol/LTris-HCl，2mmol/LEDTA，溶剂是蒸馏水，pH＝8.0本文档来自技高网...

【技术保护点】
高致病性副溶血弧菌快速检测引物，其特征是由外引物和内引物组成，所述外引物由SEQ ID NO.1所示的外引物上游引物和SEQ ID NO.2所示的外引物下游引物组成；所述内引物由SEQ ID NO.3所示的内引物上游引物和SEQ ID NO.4所示的内引物下游引物组成。

【技术特征摘要】
1.高致病性副溶血弧菌快速检测引物，其特征是由外引物和内引物组成，所述外引物由SEQ
IDNO.1所示的外引物上游引物和SEQIDNO.2所示的外引物下游引物组成；所述内引物由SEQ
IDNO.3所示的内引物上游引物和SEQIDNO.4所示的内引物下游引物组成。
2.高致病性副溶血弧菌快速检测试剂盒，其特征是包括：
(1)TE缓冲液，其组成为20mmol/LTris-HCl，2mmol/LEDTA，溶剂是蒸馏水，pH＝8.0；
(2)BstDNA聚合酶：浓度为8U/μl的BstDNA聚合酶；
(3)LAMP反应液，每24μlLAMP反应液的组成为：2.5μl10×反应缓冲液；3μl浓度为
2.5mmol/L的dNTP；1μl浓度为5μmol/L的由SEQIDNO.1所示的外引物上游引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚学良，徐晓丽，张振奎，包海岩，蔡琰，
申请(专利权)人：天津市水产技术推广站，
类型：发明
国别省市：天津;12