特异性结合前列腺癌的短肽PCP8及其应用制造技术

本发明专利技术涉及了一种特异性结合前列腺癌的短肽PCP8及其应用，提供了一系列利用噬菌体展示肽库技术筛选得到的具有靶向前列腺癌特性的多肽。本发明专利技术的结合多肽特异性高，可用于前列腺癌高危人群的普查及前列腺癌的早期临床诊断、以及治疗效果的评估。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于蛋白质多肽
，具体涉及一系列可特异性结合前列腺癌的短肽。
技术介绍
前列腺癌是严重威胁中老年男性健康的恶性肿瘤之一，而且发病率逐年上升，死亡率高，仅次于肺癌，位居第二。50多年以来，雄激素阻断治疗一直是前列腺癌的标准疗法，然而，大多数患者最终会发展为激素抵抗性前列腺癌(hormonerefractoryprostatecancer,HRPC)。对于HRPC，目前尚无有效的疗法，而现有治疗手段包括放射治疗、化学治疗等均不能延长患者生命达一年以上。因此探索新型有效的前列腺癌治疗方法，一直是泌尿外科临床所面临的重要课题之一。目前我国对于前列腺癌的筛查率相对较低，这也是造成前列腺癌死亡率偏高的重要原因之一。因此，本领域迫切需要开发可用于前列腺癌诊断的相关蛋白。而多肽因分子量小，组织穿透性好，无免疫原性且对细胞表面受体具有较高亲和力而成为靶向传递研究中的理想配体。然而已知的天然受体-配体对是非常有限的。噬菌体展示肽库技术的发展则为发现和表征新的配体及对应受体提供了有力的工具，不仅有望实现临床应用于肿瘤的靶向治疗，也有助于解释疾病发生机制的理论研究。噬菌体展示技术通过将特定片段插入噬菌体DNA中而将相应的多肽表达在pIII衣壳蛋白上，从而在噬菌体的DNA和衣壳蛋白之间搭建桥梁，使得各种靶分子的多肽配体可通过体外或体内筛选得以快速鉴定。发展至今，应用此技术已成功筛选得到针对肝癌、结肠癌、乳腺癌等多种人类肿瘤的靶向多肽，但是对于筛选前列腺癌靶向配体的相关报道则很少。因此，本专利技术利用噬菌体展示肽库技术于前列腺癌肿瘤模型体内筛选得到16条可靶向前列腺癌的短肽，并对此多肽的靶向特性进行了鉴定，以考察其作为靶向配体用于传递药物至前列腺肿瘤部位的可行性。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供一系列利用噬菌体展示肽库技术筛选得到的具有靶向前列腺癌特性的多肽。本专利技术的另一个目的是提供上述多肽在制备前列腺癌诊断试剂盒中的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案予以实现：用噬菌体展示肽库减性筛选肿瘤细胞特异性结合多肽或靶肽的方法为：通常用两个细胞系进行筛选，将噬菌体展示随机肽库先通过不含靶抗原的正常细胞筛选，未结合的上清再通过含靶抗原的细胞，筛选出噬菌体扩增后进行下一轮筛选，最终得到特异性结合肽。首先，采用上述噬菌体展示肽库减性筛选技术，以前列腺癌LNCaP和PC3细胞作为靶细胞，正常细胞为吸附细胞，对NEWENGLANDBiolabs的Ph.D.-7TMPhageDisplayPeptideLibraryKit进行四轮体外筛选，通过逐轮增强洗涤力度，获得了前列腺癌特异性的噬菌体克隆。上述的筛选后，分别于第二轮、第三轮和第四轮筛选结果中随机挑取单克隆进行DNA的提取和测序。应用生物信息学工具分析筛选得到的多肽序列，同时酶联免疫吸附实验用于分析候选噬菌体单克隆对细胞的结合能力，从而鉴定出与前列腺癌细胞具有较强的亲和力的噬菌体16个克隆，将该16个克隆送去测序，并分别命名为PCP1-16，测序结果证实PCP1-16的氨基酸序列分别如SEQIDNO：1-16所示。本专利技术筛选得到的多肽经鉴定具有以下特性及优点：多肽可有效地识别并特异性结合前列腺癌细胞系LNCaP和PC3，而对正常的前列腺细胞系RWPE-1，及其他肿瘤细胞HepG2、A549、SW480的结合能力弱，表现出针对前列腺癌特异的识别和结合能力；该多肽具有分子量小，组织穿透性好，无免疫原性且对细胞表面受体具有较高亲和力的普遍特点，该多肽可用于制备前列腺癌诊断试剂药盒，该试剂盒诊断灵敏度高、特异性高，可用于前列腺癌高危人群的普查及前列腺癌的早期临床诊断、以及治疗效果的评价与病人病情转归、预后的判断。附图说明图1为ELISA检测第四轮筛选噬菌体克隆与LNCaP和PC3的亲和力对比柱状图；其中，图1A为PCP1-20这20个噬菌体克隆分别对LNCaP的亲和力，图1B为PCP1-20这20个噬菌体单克隆分别对PC3的亲和力，21为原库随机噬菌体克隆对LNCaP的亲和力，22为原库随机噬菌体克隆对PC3的亲和力。图2为噬菌体克隆对不同细胞的体外靶向能力鉴定(噬菌体相对结合＝TU待测噬菌体克隆/TU空白对照噬菌体)。其中，图2A为噬菌体PCP1-6分别对不同细胞的结合能力结果图，图2B为噬菌体PCP7-11分别对不同细胞的结合能力结果图，图2C为噬菌体PCP12-16分别对不同细胞的结合能力结果图。具体实施方式本专利技术通过以下实施例作进一步说明，但不作为本专利技术的限制。实施例1前列腺癌特异性结合多肽的筛选本实施例采用噬菌体展示随机12肽库减性筛选与前列腺癌细胞特异性结合的多肽，其具体步骤如下：用胰酶消化人前列腺癌细胞LNCaP和PC3后，调整细胞密度，接种于预先包被多聚赖氨酸的培养皿中，待细胞长至80％-90％融合度时进行筛选实验。取上述LNCaP和PC3细胞，用无血清DMEM培养后，加入牛血清白蛋白BSA封闭，再加入20μl噬菌体肽库，孵育1.5h后，倾倒除去未结合噬菌体，倒置拍甩除去残余溶液。用洗涤液0.2％(v/v)TBST缓冲液冲洗4次，加入非特异性缓冲液0.2M甘氨酸-盐酸(pH2.2)2ml，吸出洗脱液，加入250μl5MTris-HCl(pH9.0)中和后，将洗脱液转至RWPE-1细胞中，孵育3h后，收集上清，即为第一轮筛选得到的噬菌体，将得到的噬菌体取少量利用大肠杆菌通过滴定法确定噬菌体的浓度，其余的噬菌体感染大肠杆菌进行扩增，用于下一轮的筛选。第二轮筛选时，洗涤液TBST中Tween-20浓度提高至0.5％，与LNCaP和PC3孵育时间为40min，洗涤次数增加至7次，其余条件、步骤与第一轮相同。第三轮筛选时，洗涤液TBST中Tween-20浓度提高至0.8％，与LNCaP和PC3孵育时间减少至25min，并且洗涤次数增加至10次，其余条件、步骤与第一轮相同。第四轮筛选时，洗涤液TBST中Tween-20浓度提高至1.0％，与LNCaP和PC3孵育时间减少至20min，并且洗涤次数增加至15次，其余条件、步骤与第一轮相同。测定第四轮筛选获得的噬菌体的滴度后，在LB/IPTG/Xgal平板上随机挑取蓝色噬菌斑，制备噬菌体单克隆用于鉴定。实施例2噬菌体的扩增将实施例1中，每轮筛选获得的噬菌体用LB培养基进行100倍比稀释后，取20μl稀释后噬菌体与200μl对数生长早期的大肠杆菌菌液混匀，加入到于45℃保本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种短肽，其特征在于：能特异性结合前列腺癌细胞。

【技术特征摘要】
1.一种短肽，其特征在于：能特异性结合前列腺癌细胞。
2.如权利要求1所述的短肽，其特征在于：其为PCP8，其氨基酸序列分别如SEQIDNO:8
所示。
3.如权利要求1-2所示的短肽在...

【专利技术属性】
技术研发人员：华国光，
申请(专利权)人：朱育盼，
类型：发明
国别省市：浙江;33