特异性识别重金属Cd的纳米抗体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及特异性识别重金属Cd的纳米抗体及其应用。揭示了针对重金属Cd的纳米抗体，所述的纳米抗体对于重金属Cd具有良好的特异性，与其它金属的交叉反应性很低。本发明专利技术的纳米抗体可灵敏检测重金属Cd，重复性好，结果稳定。利用所述的纳米抗体，可制备方便、快速且准确地检测重金属Cd的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及单克隆抗体
，更具体地，本专利技术涉及特异性识别重金属Cd的纳米抗体及其应用。
技术介绍
随着工业的迅速发展，镉(Cd)的生产和使用不断增加，环境镉污染及其引起的疾病不时可见报导。最近研究表明，一般人群中低剂量镉环境暴露即可引起肾功能损伤、骨矿密度降低、钙排泄增加及生殖毒性。因此检测环境中或样品中的重金属镉的存在与否以及存在量是非常重要的。传统的重金属离子检测方法主要有原子吸收光谱法、紫外分光光度法、阳极溶出伏安法、示波极谱法和各种仪器联用技术，如电感耦合等离子体质谱法、电感耦合等离子体原子发射广谱分析等；这些分析方法虽然能够对环境中的镉离子进行有效分析，而且测量精度较高，但它们大多需要大型仪器，成本高，样品要经过消解，检测步骤烦琐，不适合现场、在线分析检测，难以适应现场抽查、大规模检测的需求。重金属免疫检测方法为重金属污染物检测提供了另一种方式，这种方法检测速度快、费用低廉、易于现场使用。但是，重金属的免疫检测的关键在于重金属特异性抗体的制备。由于重金属离子带有电荷，能与动物体内生物分子发生强烈的不可逆反应，导致动物中毒，因此，常规的制备抗体的方法得不到理想的抗体。并且，重金属离子本身分子量很小不具有免疫原性，且其本身带有电荷，会与分子发生强烈的不可逆反应，所以需选择合适的载体蛋白以制成完全的免疫原。然而，即使获得了合适的携带重金属离子的免疫原，后续筛选抗体的过程r>仍然存在较多的瓶颈，特别是在完全免疫原中金属离子很小，筛选过程中获得的特异性抗体很微小，甚至难以鉴定到；而针对完全免疫原中金属离子以外的材料如螯合剂、载体蛋白的特异性抗体将占很大比例；因此筛选难度远远高于常规的单抗筛选方法。综上，本领域需要开发用于检测重金属Cd的免疫检测抗体，以期应用于实时重金属检测。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供特异性识别重金属Cd的纳米抗体及其应用。在本专利技术的第一方面，提供一种特异性识别重金属Cd的纳米抗体，所述的纳米抗体的互补决定区具有下组的氨基酸序列：SEQIDNO:2所示的CDR1，SEQIDNO:3所示的CDR2，和SEQIDNO:4所示的CDR3。在一个优选例中，所述的纳米抗体的骨架区具有下组的氨基酸序列：SEQIDNO:5所示的FR1，SEQIDNO:6所示的FR2，SEQIDNO:7所示的FR3，和SEQIDNO:8所示的FR4。在另一优选例中，所述的纳米抗体的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。在本专利技术的另一方面，提供一种多核苷酸，其编码所述的纳米抗体。在本专利技术的另一方面，提供一种表达载体，该表达载体中含有所述的多核苷酸。在另一优选例中，所述的多核苷酸可以通过分子克隆技术克隆至表达载体pET28a中，进行表达。在本专利技术的另一方面，提供一种宿主细胞(为非繁殖细胞)，该宿主细胞中含有所述的表达载体或其基因组中整合有所述的多核苷酸。在本专利技术的另一方面，提供一种产生纳米抗体的方法，包括：培养所述的宿主细胞，使之表达所述的纳米抗体。在本专利技术的另一方面，提供一种纳米抗体噬菌体(噬菌粒)，其包括：噬菌体(噬菌粒)，以及展示于噬菌体表面的所述的纳米抗体。在另一优选例中，所述的噬菌体是商业化噬菌体，即是常规用于进行蛋白展示的噬菌体。例如，所述的噬菌体是M13丝状噬菌体。在本专利技术的另一方面，提供所述的纳米抗体或所述的纳米抗体噬菌体的用途，用于检测重金属Cd；或用于制备检测重金属Cd的试剂或试剂盒。在另一优选例中，所述的用途为非诊断性的用途。较佳地，用于检测来自人体或动物体以外的样品(如水、药品、食品、农药、饲料、饮品、保健品等)中的重金属Cd。在本专利技术的另一方面，提供一种用于检测重金属Cd的试剂盒，所述的试剂盒中包括所述的纳米抗体或所述的纳米抗体噬菌体。在一个优选例中，所述试剂盒中还包括固相载体，所述的纳米抗体或纳米抗体噬菌体被固定于固相载体(如多孔板、盖玻片、微珠)或游离存在。在另一优选例中，所述试剂盒中还包括：能与所述的纳米抗体连接的可检测标记物(如HRP)，所述的可检测标记物被连接于所述的纳米抗体或分离地存在于试剂盒；和/或Cd标准品或Cd偶联物(为Cd与载体蛋白的偶联物，如Cd-DTPA-BSA、Cd-DTPA-OVA)标准品；和/或与可检测标记物相对应的底物；和/或酶联免疫反应试剂(包括但不限于：包被(缓冲)液，洗涤(缓冲)液，封闭液，固定液，终止液，显色液)；和/或说明检测重金属Cd的方法的使用说明书。在本专利技术的另一方面，提供一种检测待测样品中重金属Cd存在情况的方法，所述方法包括：以所述的纳米抗体或所述的纳米抗体噬菌体作为重金属Cd的检测抗体，通过酶联免疫反应法来检测待测样品中重金属Cd的存在情况。在另一优选例中，将待测样品包被于固相载体上，以携带或不携带可检测标记物(以携带可检测标记物的抗抗体进一步结合)的所述的纳米抗体或所述的纳米抗体噬菌体作为检测抗体，检测重金属Cd的存在情况。在另一优选例中，所述的方法为非诊断性的方法。所述的待测样品是来自人体或动物体以外的样品(如水、药品、食品、农药、饲料、饮品、保健品等)。在本专利技术的另一方面，提供一种筛选特异性识别重金属Cd的纳米抗体的方法，所述方法包括：(1)将Cd分别与载体蛋白BSA、OVA偶联，分别获得Cd与BSA偶联物和Cd与OVA偶联物；(2)分别以(1)获得的Cd与BSA偶联物和Cd与OVA偶联物作为抗原，筛选纳米抗体库，富集与之特异性结合的纳米抗体；筛选方案为以Cd与BSA偶联物和Cd与OVA偶联物交替进行筛选，筛选3-8轮；(3)应用酶联免疫反应法来鉴定特异性识别重金属Cd的纳米抗体，获得特异性良好的纳米抗体。本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明图1、本专利技术的实施例中进行的研究工作的整体流程步骤示意图。图2、SDS-PAGE分子量检测的结果。其中，1、Marker；2、BSA；3、DTPA-BSA；4、Cd-DTPA-BSA；5、OVA；6、DTPA-OVA；7、Cd-DTPA-OVA；8、Cd-DTPA-BSA超滤液；9、Cd-DTPA-OVA超滤液。图3、抗原紫外检测图谱。图4、噬菌体VHH库的富集筛选示意图。图5、Cd-DTPA抗体库第一至七轮抗体库富集度。图6、Cd-D本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特异性识别重金属Cd的纳米抗体，其特征在于，所述的纳米抗体的互补决定区具有下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2所示的CDR1，SEQ ID NO:3所示的CDR2，和SEQ ID NO:4所示的CDR3。

【技术特征摘要】
1.一种特异性识别重金属Cd的纳米抗体，其特征在于，所述的纳米抗
体的互补决定区具有下组的氨基酸序列：
SEQIDNO:2所示的CDR1，
SEQIDNO:3所示的CDR2，和
SEQIDNO:4所示的CDR3。
2.如权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述的纳米抗体的骨架
区具有下组的氨基酸序列：
SEQIDNO:5所示的FR1，
SEQIDNO:6所示的FR2，
SEQIDNO:7所示的FR3，和
SEQIDNO:8所示的FR4。
3.如权利要求1或2所述的纳米抗体，其特征在于，所述的纳米抗体的
氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。
4.一种多核苷酸，其特征在于，其编码权利要求1-3任一所述的纳米抗体。
5.一种纳米抗体噬菌体，其特征在于，其包括：噬菌体，以及展示于噬菌
体表面的权利要求1-3任一所述的纳米抗体。
6.权利要求1-3任一所述的纳米抗体或权利要求5所述的纳米抗体噬菌
体的用途，用于检测重金属Cd；或用于制备检测重金属Cd的试剂或试剂盒。
7.一种用于检测重金属Cd的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包
括权利要求1-3任一所述的纳米抗体或权利要求5所述的纳米抗体噬菌体。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括固相载

\t体，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚刚，王娟，姜忍忍，依布拉音，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31