可来源于血小板浓缩液的生物活性组合物及其制备和使用方法技术

本公开提供了包含来源于血小板浓缩液的生物活性级分的组合物、制备所述生物活性级分的方法和补充有所述生物活性级分的培养基。优选的生物活性级分具有相对低的纤维蛋白原浓度，同时保留了有益量和比例的天然生长因子。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术一般涉及来源于动物血小板产品的生物活性物质及其制备和使用方法的领域。
技术介绍
用于治疗处理的细胞或含有细胞的组合物的施用正在成为日益流行的治疗方式。这样的治疗可以包括，例如，施用具有分化成包括例如骨、脂肪、软骨和肌肉的间叶细胞谱系细胞的潜能的间充质干细胞(MSC)。为了获得治疗量的用于移植的细胞，经常需要从原始群体扩增细胞群体。用于扩增细胞群体的培养基为细胞代谢、生长和增殖提供必需营养物。经常使用胎牛血清(FBS)作为促进群体扩增的补充剂。因为FBS的低含量抗体，因为FBS包含刺激细胞生长和增殖的许多生长因子以及因为FBS的制造相对便宜，所以FBS一直是优选的补充剂。然而，FBS具有公认的缺点，包括病原体的传播风险，如牛海绵状脑病。人血小板裂解物(hPL)已作为FBS的潜在的、非异种替代品出现。hPL来源于已知含有多种生长因子的血小板。除了生长因子外，目前的hPL分离技术通常还产生保留了高浓度的纤维蛋白原(一种参与凝块形成的糖蛋白)的组合物。因为它们的纤维蛋白原含量和形成凝块的倾向，目前的商业hPL组合物经常与一种或多种抗凝添加剂，典型地肝素一起使用。hPL中的抗凝添加剂增加了hPL生产和/或使用的成本，并且在肝素的生物活性是有害的情况下，可能会存在问题。此外，虽然已经提出了多种用于生产hPL的方法，但是实现hPL产品的目标组成分布或生物活性的尝试经常导致工艺复杂性和/或密集设备要求。作为FBS的替代品的hPL的广泛采用将需要经济上可行的方法，但是该方法产生所期望的且有效的组合物。鉴于这样的背景，需要基本上不含纤维蛋白原，保留了对细胞增殖有益的生长因子并可以容易地且经济地制造的人血小板裂解物组合物。
技术实现思路
在本专利技术的某些方面，已经发现，从血源性血小板浓缩液(优选人)中可以独特地处理有利的血源性血小板浓缩液的生物活性级分。生物活性级分可以具有存在于起始浓缩液中的生长因子和/或其它物质的新的组成分布，并且处理方法可以涉及凝结和分离浓缩液级分的新技术和/或新的用来澄清来源于浓缩液的液体级分的深层过滤操作。在一个方面，用于处理血小板裂解物组合物的方法包括如下步骤：裂解含有血小板和血浆的人血源性浓缩液的血小板以形成裂解的血小板制备物，通过将裂解的血小板制备物中的纤维蛋白原转化为纤维蛋白形成凝块凝胶，以及压榨凝块凝胶以从凝块凝胶中压出液体。在另一个方面，方法包括使血源性血小板浓缩液的液体生物活性级分通过至少第一深层过滤器，以便从生物活性级分中除去悬浮固体，所述血源性血小板浓缩液的液体生物活性级分包含血小板浓缩液的天然组分，包括纤维蛋白原、白蛋白、球蛋白，和TGF-β1、EGF、FGF-β、PDGF-AA、PDGF-BB、SDF-1α及VEGF中的至少一种，任选地全部，其中纤维蛋白原以低于20,000ng/mL的含量存在。血小板浓缩液优选是人血小板浓缩液。在优选的方式中，液体生物活性级分通过第一深层过滤器，还通过第二深层过滤器，其中第二深层过滤器任选具有比第一深层过滤器小的公称微米等级。在另一个方面，提供了包含人血源性血小板浓缩液的生物活性级分的组合物，该血小板浓缩液含有人血小板和人血浆，该生物活性级分包含血小板浓缩液的天然组分，包括纤维蛋白原、白蛋白、球蛋白、TGF-β1、EGF、FGF-β、PDGF-AA、PDGF-BB、SDF-1α和VEGF。生物活性级分可具有以低于约20,000ng/mL的含量存在，例如在约500ng/mL至约20,000ng/mL范围内的纤维蛋白原，和/或生物活性级分或含有它的细胞培养基可以不含或基本上不含所添加的肝素(即，非原产于血小板浓缩液起始原料的肝素)。生物活性级分可以具有如本文所公开的生长因子含量或比例。在某些实施方案中，生物活性级分是液体生物活性级分，并且天然组分包括：含量低于20,000ng/mL液体生物活性级分，例如在约500ng/mL至约20,000ng/mL液体生物活性级分范围内的纤维蛋白原；含量为至少2mg/dL液体生物活性级分的白蛋白；含量为至少1g/dL液体生物活性级分的球蛋白；含量为至少5000皮克/毫升(“pg/mL”)液体生物活性级分的TGF-β1；含量为至少20pg/mL液体生物活性级分的EGF；含量为至少5pg/mL液体生物活性级分的FGF-β；含量为至少200pg/mL液体生物活性级分的PDGF-AA；含量为至少50pg/mL液体生物活性级分的PDGF-BB；含量为至少100pg/mL液体生物活性级分的SDF-1α；和含量为至少10pg/mL液体生物活性级分的VEGF。本公开还提供了用于制备生物活性组合物的方法，包括如下步骤：将凝结剂添加到血小板裂解物组合物中以形成凝结物质，将凝结物质中的凝结固体与液体分离，以及使液体经受深层无菌过滤。在一些形式中，该方法还包括将生物活性组合物包装于无菌容器中。在某些实施方案中，生物活性级分是液体生物活性级分，并且天然组分包括：含量在约200pg/mL至约350pg/mL之间的FGF-2；含量在约1800pg/mL至约3100pg/mL之间的EGF；含量在约24,000pg/mL至约28,000pg/mL之间的PDGF-AA；含量在约50ng/mL至约80ng/mL之间的PDGF-BB；含量在约500pg/mL至约800pg/mL之间的VEGF；含量在约60ng/mL至约90ng/mL之间的TGF-b；和含量低于2.5μg/mL的纤维蛋白原。本文公开的另外的实施方案涉及本文所描述的生物活性级分或组合物用于细胞培养、冷冻保存或治疗目的的用途。通过本文的说明，对本
的普通技术人员来说，更进一步的实施方案以及特征和优点将是显而易见的。附图说明图1示出了用于制备人血小板浓缩液组合物的液体生物活性级分的方法。图2是无菌包装中本公开的液体生物活性级分的一个实施方案的透视图。图3是滴瓶中本公开的液体生物活性级分的一个实施方案的透视图。具体实施方式为了有助于对本专利技术的原理的理解的目的，现在将参照某些实施方案并且使用特定的语言来描述它们。然而应当理解的是，无意因此限制本专利技术的范围。所描述的实施方案中的任何变化和进一步的修改，以及如本文中所描述的本专利技术的原理的任何进一步的应用都视为本专利技术所涉及的领域的技术人员通常会想到的。一般来本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种组合物，所述组合物包含：人血源性血小板浓缩液的生物活性级分，所述血小板浓缩液含有人血小板和人血浆，所述生物活性级分包含所述血小板浓缩液的天然组分，包括纤维蛋白原、白蛋白、球蛋白，和TGF‑β1、EGF、碱性FGF、PDGF‑AA、PDGF‑BB、SDF‑1α及VEGF中的至少一种。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.08.27 US 61/870,6861.一种组合物，所述组合物包含：
人血源性血小板浓缩液的生物活性级分，所述血小板浓缩液含有人血小板和人
血浆，所述生物活性级分包含所述血小板浓缩液的天然组分，包括纤维蛋白原、
白蛋白、球蛋白，和TGF-β1、EGF、碱性FGF、PDGF-AA、PDGF-BB、SDF-1α
及VEGF中的至少一种。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述纤维蛋白原以低于20,000ng/mL的含
量存在。
3.如权利要求1或2所述的组合物，所述组合物包含所述TGF-β1、EGF、碱
性FGF、PDGF-AA、PDGF-BB、SDF-1α和VEGF中的每一种。
4.如前述任一项权利要求所述的组合物，其中所述组合物基本上不含肝素。
5.如前述任一项权利要求所述的组合物，其中所述生物活性级分还包括原产
于所述血小板浓缩液的IL-1b、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、IL-17、IFN-γ和TNF-α
中的至少一种，优选每一种。
6.如前述任一项权利要求所述的组合物，其中所述生物活性级分是液体生物
活性级分，并且其中所述组合物包含：
约0.5至2.5g/dL的球蛋白，优选约1至2g/dL的球蛋白；
约2至5g/dL的白蛋白，优选约3至4g/dL的白蛋白；
约100至200mmol/L的钠，优选约120至约160mmol/L的钠；
约50至120mg/dL的甘油三酯，优选约60至110mg/dL的甘油三酯；和/或
约150至300mg/dL的葡萄糖，优选约150至250mg/dL的葡萄糖。
7.如前述任一项权利要求所述的组合物，所述组合物不含洗涤剂残留物。
8.如前述任一项权利要求所述的组合物，其中所述生物活性级分是液体生物
活性级分，并且其中所述PDGF-BB的浓度低于1000pg/mL。
9.如前述任一项权利要求所述的组合物，其中所述生物活性级分是液体生物
活性级分，并且其中所述PDGF-AA的浓度低于3000pg/mL。
10.如前述任一项权利要求所述的组合物，其中所述生物活性级分是液体生物
活性级分，并且其中所述TGF-β1的浓度为至少5000pg/mL。
11.如前述任一项权利要求所述的组合物，其中所述生物活性级分是液体生物
活性级分，并且其中所述VEGF的浓度低于300pg/mL。
12.如前述任一项权利要求所述的组合物，其中所述生物活性级分是液体生物
活性级分，并且其中所述天然组分包括：
含量低于20,000ng/mL所述液体生物活性级分的纤维蛋白原；
含量为至少2mg/dL所述液体生物活性级分的白蛋白；
含量为至少1g/dL所述液体生物活性级分的球蛋白；
含量为至少5000pg/mL所述液体生物活性级分的TGF-β1；
含量为至少20pg/mL所述液体生物活性级分的EGF；
含量为至少5pg/mL所述液体生物活性级分的FGF-β；
含量为至少200pg/mL所述液体生物活性级分的PDGF-AA；
含量为至少50pg/mL所述液体生物活性级分的PDGF-BB；
含量为至少100pg/mL所述液体生物活性级分的SDF-1α；和
含量为至少10pg/mL所述液体生物活性级分的VEGF。
13.如前述任一项权利要求所述的组合物，其中：
所述组合物具有260-340mmol/kg之间的摩尔渗透压浓度。
14.如前述任一项权利要求所述的组合物，其中：
所述组合物具有在6.8至7.8的范围内的pH。
15.如前述任一项权利要求所述的组合物，其中：
所述组合物不含非原产于所述血小板浓缩液的肝素。
16.一种细胞培养基，所述细胞培养基包含根据权利要求1至15中任一项所
述的组合物。
17.如权利要求16所述的细胞培养基，所述细胞培养基不含肝素。
18.一种用于制备生物活性组合物的方法，所述方法包括：
将凝结剂添加到血小板裂解物组合物中形成凝结物质；
将所述凝结物质中的凝结固体与液体分离；以及
对所述液体进行深层过滤。
19.如权利要求18所述的方法，其中：
用带正表面电荷的深层过滤介质进行所述深层过滤。
20.如权利要求18或19所述的方法，其中：
所述凝结剂包括氯化钙盐。
21.如权利要求18至20中任一项所述的方法，还包括：
对所述液体进行无菌过滤。
22.如权利要求18至21中任一项所述的方法，其中：
通过包括冷冻和解冻血小板浓缩液组合物以便裂解其中的血小板的方法来制
备所述血小板裂解物组合物。
23.如权利要求22所述的方法，其中：
所述血小板浓缩液组合物包括含有血小板和血浆的机采人血小板组合物。
24.如权利要求18至23中任一项所述的方法，所述方法还包括：
将所述生物活性组合物包装于无菌容器中。
25.一种治疗患者，任选地人类患者的方法，所述方法包括：
施用包含权利要求1至15中任一项所述的组合物的治疗性物质。
26.一种用于制备生物活性组合物的方法，所述方法包括：
裂解含有血小板和血浆的人血源性浓缩液的血小板以形成裂解的血小板制备
物；
通过将所述裂解的血小板制备物中的纤维蛋白原转化为纤维蛋白形成所述裂
解的血小板制备物的凝胶凝块；
压榨所述凝胶凝块以将液体从凝胶凝块中压出；以及
将所述凝胶凝块的液体与固体分离。
27.一种用于处理血小板裂解物组合物的方法，所述方法包括：
裂解含有血小板和血浆的人血源性浓缩液的血小板以形成裂解的血小板制备
物；
压榨通过将裂解的血小板制备物中的纤维蛋白原转化成纤维蛋白形成的凝胶
凝块以便将液体从所述凝胶凝块中压出。
28.一种用于处理血小板裂解物组合物的方法，所述方法包括：
使人血源性血小板浓缩液的液体生物活性级分通过至少第一深层过滤器，以便
从所述液体生物活性级分中除去悬浮固体，所述人血源性血小板浓缩液液体生物
活性级分包含所述血小板浓缩液的天然组分，包括纤维蛋白原、白蛋白、球蛋白、
TGF-β1、EGF、FGF-β、PDGF-AA、PDGF-BB、SDF-1α和VEGF，其中所述纤维
蛋白原以低于20,000ng/mL的含量存在。
29.如权利要求28的所述方法，所述方法还包括获得所述血源性血小板浓缩
液的所述液体生物活性级分，而不进行使所述浓缩液的凝结级分与所述浓缩液的
所述液体生物活性级分分离的离心步骤。
30.如权利要求28所述的方法，其中所述获得包括：
裂解所述浓缩液的血小板以形成裂解的制备物；
将所述裂解的制备物的纤维蛋白原转化为纤维蛋白以便形成凝胶凝块；以及
压榨所述凝胶凝块而不进行离心以便将所述液体生物活性级分从所述凝胶凝
块中压出。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述压榨包括对在第一表面和第二表面
之间并与所述第一表面和所述第二表面接触的凝胶凝块进行压榨以便将所述液体
生物活性级分从所述凝胶凝块中压出以及留下固体凝块团。
32.如权利要求28-31中任一项所述的方法，其中所述通过使得：
TGF-β-1、EGF、FGF-b、PDGF-AA、PDGF-BB、SDF-1α和VEGF中的一种、
一些或所有的含量降低至少20％；和/或
TGF-β-1的含量降低至少50％；和/或
EGF的含量降低至少30％；和/或
FGF-b的含量降低至少20％；和/或
PDGF-AA的含量降低至少...

【专利技术属性】
技术研发人员：E·J·伍兹，C·G·泰勒，
申请(专利权)人：库克通用生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国;US