一种新型真核表达系统、其构建方法及应用技术方案

本发明专利技术的一种新型真核表达系统、其构建方法及应用属于生物技术领域。本发明专利技术设计不同长度的PolyA转录终止基因序列，并采用双启动子的表达方式构建新型真核表达系统。用于目标蛋白质的生产表达，可以提高目标蛋白质的生产表达量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，更具体地，本专利技术公开了一种新型真核表达系统、其构建方法及应用。
技术介绍
CHO表达系统是被目前被广泛应用于大分子蛋白药物制备的真核表达系统。尤其是抗体类药物，大部分均为CHO表达系统表达。CHO细胞属于哺乳动物细胞，其进化程度高，有完善的蛋白翻译及修饰系统（含有丰富的内质网和高尔基体），因而其表达的蛋白从结构到功能均与人体内蛋白相近，作为药用蛋白，副作用的风险较小。其次，通过成熟的CHO表达平台，创新性表达Fab片段，加上特异性载体构建，可以高效率的制备复杂结构的大分子蛋白，包括抗体类药物，其表达量一般都达到克每升的水平，远高于原核表达系统。对于当今生物技术产业而言，如何更经济的进行重组蛋白的大规模表达、纯化，已成为日益重要的问题。一般而言，重组蛋白的表达主要通过将编码目的蛋白的基因插入到相应的表达载体后，利用哺乳动物细胞工程株或大肠杆菌细胞工程株进行生产。产生的重组蛋白质要么直接分泌到细胞外的培养基中，要么就定留在细胞内部。对于后者而言，目的蛋白的纯化过程就需要增加裂解细胞的步骤，比如超声波法、渗透压休克法、酶解法等。但是这些裂解细胞的方法都会浆细胞中的其它蛋白释放出来，继而增加了后续纯化的压力。同样的，对于直接分泌到胞外的蛋白而言，由于培养过程中细胞的希望，也会释放出细胞宿主蛋白，进而影响下游纯化。对于治疗用的蛋白药物（如抗体），往往需要较高的纯度来保证避免杂质带来的毒性或免疫原性。至今为止，抗体及抗体片段的生产主要是依靠哺乳动物细胞，但也有大肠杆菌E.coli及酵母（毕赤酵母）等系统被使用。选择何种生产方式主要决定于抗体产品的种类、生产规模、成本、关键风险及生物安全性（HumphreysandGlover，2001）。此外，也要考虑发酵平台的成本、操作时间、培养基添加物、资产折旧，以及“下游过程”。而然，对于抗体类的蛋白药物而言，目前几乎都是使用哺乳动物细胞表达系统。虽然哺乳动物细胞表达系统有生产成本高，周期长的缺点，但其优势也非常明显：有完善的翻译修饰系统，表达的重组蛋白空间结构正确率高，即哺乳动物细胞系统表达的蛋白药物质量要远高于原核表达系统。生物制药领域中宿主细胞的选择需要关注以下几个重要的方面：糖基化及其他翻译后修饰类型避免带来免疫原性；宿主细胞适于生物反应器的大规模培养，并能在无动物源性成分的化学成分限定性（chemicallyde?nedandanimalcomponentfree，ACDF）培养基中生长至高密度；病毒安全性；适于在ACDF中进行克隆及压力筛选。已经获得FDA、EMA批准的多数治疗性单克隆抗体选用CHO细胞作为宿主细胞，另外还有少量选用小鼠骨髓瘤细胞系，如NS0和SP2/0-Ag14。另外还有BHK21、HEK293、HKB11等细胞用于蛋白稳定表达的报道。另外还有人视网膜母细胞瘤Per.C6用于抗体稳定表达。其他用于蛋白稳定表达的细胞还有鸟类胚胎干细胞EB66、人神经元细胞以及转化的人原代细胞等。CHO细胞可以在生物反应器中高密度生长，易于进行基因操作，N-糖基化类型与人类相似，较低的病毒传播风险，因此广泛用于生物制药领域。工业生产中最常使用的克隆为CHO-K1，CHO-DXB11和CHO-DG44。CHO-K1与原代CHO近似，而DXB11和DG44为经过随机突变缺失DHFR基因，从而可以通过代谢缺陷标记进行基因扩增。CHO-K1使用GS筛选系统，但GS在CHO-K1中有内源性表达，因而降低了筛选的效率。高效的表达系统，除了表达细胞外，表达载体的构建也十分关键。表达载体中，启动子、增强子、信号肽以及polyA尾对于转录及翻译非常关键。其中polyA尾对于目的mRNA的合成至关重要，因为它通过影响转录的终止效率直接决定了mRNA的数量，而mRNA的量会进而影响翻译，即目的蛋白的产量。通过比较不同来源的polyA尾，发现了它们之间有一定的同源性，可以判断有共同的功能特点。在连续的A之后，有能够形成茎环结构的stem序列及loop序列，最后有连续T的序列。目前最为常用的polyA序列是：SV40polyA，然而有研究发现，选择合适的polyA可以有效增高目的蛋白的表达量。然而，目前还未有一种通用的polyA序列可以用于所有的表达系统。因此，有必要设计一种polyA序列，可以持续地，直接有效地增加表达产量。
技术实现思路
为了寻找最佳的polyA序列，本专利技术的专利技术人设计了16种不同的polyA序列。为了评估这16种序列的效果，它们被用于表达一种抗体Fab片段，Ranitizumab。Ranibizumab是FDA批准的首个用于治疗年龄相关性黄斑退行性病变的VEGF拮抗剂（抗体Fab段）。但是目前上市的Ranibizumab是由大肠杆菌表达系统生产的，存在产量低及存在非正确折叠的缺陷，造成该药品的价格较高及有潜在的副作用的风险。本专利技术用Ranibizumab来验证该新型真核表达系统，主要的考察参数包括mRNA的量及蛋白产量。mRNA的检测通过半定量PCR进行分析，而蛋白产量直接检测。本专利技术公开了：1、一种新型真核表达系统，其特征在于，所述真核表达载体含有不同长度的PolyA转录终止序列。2、上述的一种新型真核表达系统，其中所述真核表达载体含有的PolyA转录终止序列具有5’GACGAATTCCAGAAAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGCCTCCCAAATCGGGGGGCCTTTTTTATTTTTTTCTT3’的序列。3、上述的一种新型真核表达载体，其中所述载体含有双启动子连接目标蛋白质的基因序列。4、上述的一种新型真核表达载体，其中所述蛋白质选自完整抗体、抗体片段、细胞因子和其他类似物。5、上述的一种新型真核表达载体，其中所述蛋白质为抗体。6、上述的一种新型真核表达载体，其中所述蛋白质为Ranitizumab。7、一种载体，含有权利要求1、2、3所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，其中载体可以为pDR1，pcDNA3.1（+），pcDNA3.1/ZEO（+），pDHFR之一。8、上述一种新型真核表达系统的构建方法，其特征在于，所述宿主细胞为真核哺乳动物细胞CHO。9、一种新型真核表达系统的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：a）设计合成新型转录终止序列；b）设计合成双启动子连接的目标抗体轻链、重链基因序列；c）将a）、b）所得基因序列连接，构建新型重组质粒；d）利用步骤c）所得核苷酸片断构建的重组质粒，转染宿主细胞，筛选高表达克隆；e）通过检测目标蛋白质mRNA表达水平及目标蛋白质的表达量来筛选最佳表达系统10、一种新型真核表达体统的应用，其特征在于，提高目标蛋白质的表达量。11、上述一种新型真核表达系统用于表达完整抗体或抗体片段或细胞因子或其他类似物。本专利技术设计了16种不同长度的PolyA转录终止序列，并采用双启动子的形本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新型真核表达系统，其特征在于，所述真核表达载体含有不同长度的PolyA转录终止序列。

【技术特征摘要】
1.一种新型真核表达系统，其特征在于，所述真核表达载体含有不同长度的PolyA转录终止序列。
2.权利要求1所述的一种新型真核表达系统，其中所述真核表达载体含有的PolyA转录终止序列具有5’GACGAATTCCAGAAAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGCCTCCCAAATCGGGGGGCCTTTTTTATTTTTTTCTT3’的序列。
3.权利要求1所述的一种新型真核表达载体，其中所述载体含有双启动子连接目标蛋白质的基因序列。
4.权利要求3所述的一种新型真核表达载体，其中所述蛋白质选自完整抗体、抗体片段、细胞因子和其他类似物。
5.权利要求3所述的一种新型真核表达载体，其中所述蛋白质为抗体。
6.权利要求3所述的一种新型真核表达载体，其中所述蛋白质为Ranitizumab。
7.一种载体，含有权利要求1、2、3所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱卫珠，
申请(专利权)人：上海张江生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31