一种人原代气道上皮细胞培养方法技术

本发明专利技术提供一种人原代气道上皮细胞的培养方法，通过清除气道脂肪及纤维组织，切成小块贴在预铺有IV胎盘胶原的24孔培养板中，加入150μl BMGM培养基，待上皮细胞从组织块边缘爬出，密度达70％时将组织块移至新的预铺IV胶原的孔内继续培养，重复5‑8次，至细胞增殖80‑90％丰度时，用胰酶‑EDTA消化；采用差异贴壁法去除成纤维细胞后，加入BEGM培养基重悬上皮细胞，接种于新的预铺IV胎盘胶原的培养皿中，传代比例不大于1:3，每3天换液1次，即完成细胞培养。本发明专利技术培养方法设计合理，结果稳定，重复性好，培养的细胞形态均一，生长良好，且具有典型的气道上皮细胞细胞的形态及特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物
，涉及一种原代细胞培养方法，尤其是一种气道上皮细胞的培养方法。
技术介绍
支气管哮喘及慢性阻塞性肺疾病是最常见的慢性气道疾病。中国是一个慢性气道疾病大国，预计有超过1亿患者。气道上皮作为肺固有免疫的第一道防线在慢性气道疾病的发病中扮演重要角色。正常人支气管上皮细胞主要功能：(1)支气管表面的上皮细胞构成了基底柱状结构，清除粘液纤毛。(2)由纤毛、无纤毛和分泌黏液的细胞等组成物理屏障。(3)产生和分泌大量化学介质和细胞因子形成高度复杂的宿主防御系统。因此气道上皮细胞是研究慢性气道疾病发病机制的重要材料。目前针对气道上皮细胞的研究主要采用永生化的上皮细胞系，而原代培养多采用酶消化法，动物来源主要是小鼠。然而细胞系及小鼠气道上皮细胞与在体人气道上皮细胞差异大，故若能采用原代人气道上皮细胞进行慢性气道疾病相关研究的意义明显优于细胞系和动物细胞。但因取材困难，且人类是高等进化的生物体其细胞在体外成功培养远远难于低等生物，同时因为成人细胞体外生长的潜伏期明显长于啮齿类动物，所以体外成功培养愈加困难。现有的研究采用酶消化法分离培养人气道上皮细胞，但该方法需要组织较大，消化条件要求严格，往往因不同厂家，甚至同一厂家不同批次的消化酶的差异，需要重新优化培养条件，培养稳定性差。部分学者也从海外购买原代人气道上皮细胞株进行实验，但细胞株价格昂贵且无法多次传代，国内一般的实验室难以大量使用；同时生物制品进口海关审批手续繁琐，周期长，往往得到的细胞株状态差，成活率极低。综上所述，寻找一种高效、简便、成本低的人气道上皮细胞原代培养的方法成为了实验成功的关键。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种人气道上皮细胞的培养方法。该培养方法技术稳定，重复性好，培养的细胞形态均一，生长良好，且具有典型的上皮细胞的形态及特点。本专利技术的一种人原代气道上皮细胞的培养方法，通过以下技术方案实现：(1)收集带有气道相对正常的肺组织样品，将组织储存在预冷的含有双抗的无菌PBS溶液中；其中预冷条件优选为在冰上预冷；含有双抗的无菌PBS溶液配方为100mg/ml青霉素及100mg/ml链霉素，肺组织样品在PBS溶液中储存时间为12h以内。(2)在24孔细胞培养板内预铺IV型胎盘胶原醋酸溶液：用醋酸溶液溶解IV型胎盘胶原(商品化制剂：Sigma-alorichC5533)，溶液终浓度为0.05mg/ml，每个24孔板加入500μl，每孔胶原浓度为13.2μg/cm2，置于超净台内过夜风干备用；其中所述醋酸溶液为无菌去离子水10ml+冰乙酸200ul，预铺胶原板储存条件为-20℃，1个月。(3)将步骤(1)组织样品放入含预冷PBS的无菌培养皿中，在显微镜下分离出直径约1cm带软骨环的气道，在显微镜下仔细去除气道外层的脂肪及纤维组织，用预冷的含有双抗的无菌PBS溶液冲洗气道内分泌物，将组织样品切成大小约3×3mm的组织块，贴于步骤(2)制备的培养板中，贴块方向为气管上皮面贴于板上；(4)每个培养孔加入150μl的BEGM培养基，置入培养箱培养；(5)待上皮细胞从组织块边缘爬出，密度达70％时将组织块移至新的预铺IV胎盘胶原的孔内继续培养，由此获得原代气道上皮细胞；(6)当原代气道上皮细胞扩增至80-90％丰度时，用室温无菌PBS溶液清洗后，加入加入0.3-0.5ml0.1％-0.2％胰蛋白酶溶液37℃消化1-2分钟，当细胞出现回缩、细胞间隙增大时，加入1mlDMEM完全培养基终止消化并离心，采用差异贴壁法纯化上皮细胞后，沉淀用BEGM培养基重悬细胞，接种于预铺IV胎盘胶原的培养皿中，每3天换液1次，即完成传代细胞培养，获得传代培养的人气道上皮细胞。优选的传代比例不大于1:3。差异贴壁法：离心去上清，用预热DMEM完全培养基重悬细胞沉淀，接种于没有预铺IV胎盘胶原的培养皿中，在培养箱中静置10min后小心吸取上清，再次离心去上清，取沉淀。离心条件为1000rpm离心1分钟。其中DMEM完全培养基的预热的优选条件为37℃水浴。所述的BEGM为BEBM(BronchialEpithelialBasalMedium)500ml中加入表皮生长因子(hEGF,0.5ml)、牛胰岛素(Insulin,0.5ml)、转铁蛋白(Transferrin,0.5ml)、三碘甲状腺素(Triiodothyronine,0.5ml)、氢化可的松(Hydrocortisone,0.5ml)、视磺酸(RetinoicAcid,0.5ml)、肾上腺素(Epinephrine,0.5ml)、小牛垂体提取物(BPE,2.0ml)、GA,0.5ml。所述的步骤(4)和(6)中的培养条件为37℃、5％CO2。所述的步骤(5)中细胞爬出时间约为3-5天，组织块可重复贴块5-8次。所述的步骤(6)中的胰蛋白酶溶液中含有0.1％-0.2％EDTA(乙二胺四乙酸)，每孔加量0.3-0.5ml，消化时间为1-2分钟；DMEM完全培养基为加入10％胎牛血清的DMEM培养基。本专利技术方法中患者年龄、性别及原发病不限。本专利技术相对于现有技术具有如下优点和效果：(1)成纤维细胞污染是现有方法培养气道上皮细胞的缺陷之一。本方法借助显微镜等精细工具去除气道外层纤维组织；使用上皮细胞特异性培养基；传代时又利用上皮细胞和成纤维细胞贴壁的时间差异性，在培养及传代中最大限度纯化上皮细胞。(2)培养方法所需标本来源丰富，所有带有1cm直径气道的标本均可作为组织来源。(3)培养方法成本低，技术稳定，重复性好，培养的细胞形态均一，生长良好。(4)本专利技术可培养正常及病理状态下气道上皮细胞，用于上皮细胞的生理及病理生理学研究，离体细胞特性更接近与疾病状态，为进一步深入探索支气管肺疾病，尤其是哮喘及慢性阻塞性肺疾病等慢性气道疾病的发病机制奠定了条件，提供了丰富的材料来源。附图说明图1是倒置相差显微镜(100X)下组织贴块后3-5天上皮细胞逐渐从组织块周边爬出的照片。图2是倒置相差显微镜(400X)下组织第5次贴块培养后3-5天人气道上皮细胞的照片。图3是倒置相差显微镜(100X)下采用酶消化法分离培养7天的气道上皮细胞。图4是倒置相差显微镜(400X)下组织贴块后上皮细胞生长至90％丰度的照片。图5是倒置相差显微镜(400X)下传代培养3天人气道上皮细胞的照片。具体实施方式下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此，根据本专利技术的上述内容本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人原代气道上皮细胞培养方法，其特征在于：通过以下步骤实现：(1)收集带有气道的肺组织样品，将组织样品储存在预冷的含有双抗的无菌PBS溶液中；(2)在24孔细胞培养板内预铺IV型胎盘胶原醋酸溶液，置于超净台内过夜风干备用；(3)将步骤(1)组织样品放入含预冷PBS的无菌培养皿中，在显微镜下分离出直径约1cm的气道，用预冷的含有双抗的无菌PBS溶液冲洗后，切块贴于步骤(2)制备的培养板中；(4)每个培养孔加入150μl的BEGM培养基，置入培养箱培养；(5)待上皮细胞从组织块边缘爬出，密度达70％时将组织块移至新的预铺IV胶原的孔内继续培养，由此获得原代气道上皮细胞；(6)当原代气道上皮细胞扩增至80‑90％丰度时，加入0.3‑0.5ml 0.1％‑0.2％胰蛋白酶溶液37℃消化1‑2分钟，加入1ml DMEM完全培养基终止消化并离心，采用差异贴壁法纯化上皮细胞后，用BEGM培养基重悬细胞，接种于预铺IV胎盘胶原的培养皿中，每3天换液1次，即完成传代细胞培养，获得传代培养的人气道上皮细胞。

【技术特征摘要】
1.一种人原代气道上皮细胞培养方法，其特征在于：通过以下步骤实现：
(1)收集带有气道的肺组织样品，将组织样品储存在预冷的含有双抗的无菌PBS溶液中；
(2)在24孔细胞培养板内预铺IV型胎盘胶原醋酸溶液，置于超净台内过夜风干备用；
(3)将步骤(1)组织样品放入含预冷PBS的无菌培养皿中，在显微镜下分离出直径约1cm
的气道，用预冷的含有双抗的无菌PBS溶液冲洗后，切块贴于步骤(2)制备的培养板中；
(4)每个培养孔加入150μl的BEGM培养基，置入培养箱培养；
(5)待上皮细胞从组织块边缘爬出，密度达70％时将组织块移至新的预铺IV胶原的孔内
继续培养，由此获得原代气道上皮细胞；
(6)当原代气道上皮细胞扩增至80-90％丰度时，加入0.3-0.5ml0.1％-0.2％胰蛋白酶溶液
37℃消化1-2分钟，加入1mlDMEM完全培养基终止消化并离心，采用差异贴壁法纯化上皮
细胞后，用BEGM培养基重悬细胞，接种于预铺IV胎盘胶原的培养皿中，每3天换液1次，
即完成传代细胞培养，获得传代培养的人气道上皮细胞。
2.根据权利要求1所述的一种人原代气道上皮细胞培养方法，其特征在于：步骤(2)所
述IV胎盘胶原溶液终浓度为0.05mg/ml，IV胎盘胶原铺板浓度为13.2μg/cm2，IV胎盘胶原
板储存条件为-20℃，1个月。
3.根据权利要求1所述的一种人原代气道上皮细胞培养方法，其特征在于：步骤(3)所
述组织块为...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏旸，富祯祯，王绍斌，张斌，李雯，沈华浩，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33