本发明专利技术公开了一种柔嫩艾美耳球虫基因，该基因为Et STK基因，包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。同时提供一种防治鸡球虫病的疫苗的制备方法：将柔嫩艾美耳球虫保守蛋白Et STK的成熟肽与大肠杆菌或毕赤酵母细胞的表达载体相连获重组表达载体，再将重组表达载体转入大肠杆菌或毕赤酵母细胞宿主获得重组菌株，培养该重组菌株，即得防治鸡球虫病的疫苗，具有很高的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及一种柔嫩艾美耳球虫EtSTK基因及其应用。
技术介绍
鸡球虫病是几种艾美耳球虫寄生肠道所引起的一种危害极其严重的全球性寄生虫病，严重危害鸡的生长发育，是集约化养鸡业危害最大的疾病之一，每年给养鸡业造成巨大的经济损失。柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)是致病性最为严重的鸡球虫之一，它主要寄生于盲肠及其附近区域，能够引起出血性肠炎，对雏鸡危害最大，严重时能引起较高的死亡率。目前控制鸡球虫病的方法主要以在饲料中添加抗球虫药物预防为主，但由于抗球虫药的长期使用，鸡球虫耐药性的产生已成为无法避免的问题，任何一种抗球虫药在使用一定时间后都会引起球虫的耐药性，使得许多抗球虫药的防治效果显著降低，甚至完全失效，即使提高药物浓度也无济于事，仍然爆发球虫病，给养鸡业带来了无法弥补的损失。同时因球虫产生耐药性，使好不容易筛选出来的抗球虫药使用年限大大缩减，新药开发速度已赶不上耐药株出现的速度。而且抗球虫药作为饲料添加剂的潜在危害又逐渐成为人们关注的对象，食品安全日益受到关注，很多曾经效果很好的抗球虫药都被划入禁用之列，因此，人们期待用更理想的方法来替代抗球虫药物的使用。球虫活卵囊疫苗的成功研制和应用提供了一种可以替代药物控制鸡球虫病的技术手段。但活疫苗不可避免地存在难保存、散毒及潜在的致病威胁等缺点，未能在鸡场得到广泛使用，所以迫切需要寻找新的防治手段来控制鸡球虫病。而研制新疫苗和新药物的关键在于寻找到合适的虫体抗原基因或基因产物作为防治球虫病的作用靶标。鸡球虫是属于顶复器门(Apicomplexa)艾美耳属(Eimeria)的一类寄生于鸡肠道的原虫。顶复器原虫多数是专一性的细胞内寄生虫，包括疟原虫(Plasmodium)、弓形虫(Toxoplasma)、艾美耳球虫(Eimeria)、隐孢子虫(Cryptosporidium)等，有复杂的生活史，需入侵宿主细胞，完成生活史循环需要更替一个或多个宿主，或更换不同的细胞和组织，因而成功地入侵宿主细胞是这类寄生虫感染建立的前提。虽然顶复器原虫入侵的宿主细胞不同，包括红细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和消化道细胞等，但都有一个共同的高度保守的入侵机制，需要顶复器(微线、棒状体和致密颗粒)分泌一系列蛋白参与，这些蛋白相互作用，在宿主细胞膜与虫体表面形成一个高度保守的运动结构(MovingJunction，MJ)，对虫体入侵宿主细胞起至关重要的作用。
技术实现思路
本专利技术要解决针对药物防治球虫病极易产生耐药性的问题急需开发新型疫苗和新药的技术问题，提供一种柔嫩艾美耳球虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(EtSTK)基因，该EtSTK在柔嫩艾美耳球虫入侵宿主细胞过程中起着重要作用，对开发防治鸡球虫病的新疫苗或新药具有很高的应用价值。此外，还需要提供一种柔嫩艾美耳球虫EtSTK基因的应用。为了解决上述技术问题，本专利技术通过如下技术方案实现：在本专利技术的一个方面，提供了一种柔嫩艾美耳球虫基因，该基因为ETSTK基因，包含SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。在本专利技术的一个方面，利用5’RACE和3’RACE首次扩增了柔嫩艾美耳球虫EtSTK基因的全长序列，如SEQIDNO.2所示。该序列全长1799bp，除了ORF(102-1625bp)与NCBI中柔嫩艾美耳球虫未知蛋白ZB1-A08100％同源外，该序列还包括5’的UTR序列，长101bp，含有CAAT序列，没有TATA序列；3’端UTR序列，长174bp，含poly(A)尾，没有典型的AATAAA序列。5’-UTR和3’-UTR可通过一些调控因子的结合来对该基因的表达进行调控。mRNA分子的5’UTR通过其长度和碱基顺序以及二级结构等来参与表达调控。其中5’-UTR主要参与翻译调节，影响转录后的各个阶段，包括mRNA的稳定，折叠和核糖体的相互作用；3’-UTR影响RNA的水平，从而影响翻译后蛋白的表达量，因此，5’-UTR和3’-UTR在真核生物基因的转录、翻译和表达过程中发挥重要作用。在本专利技术的另一方面，提供了一种重组载体，包含编码EtSTK蛋白氨基酸序列的核苷酸序列。所述重组载体包括重组克隆载体或重组表达载体，重组表达载体包括重组原核表达载体、重组真核表达载体。在本专利技术的另一方面，还提供了一种重组蛋白，该重组蛋白是由上述重组载体经表达而制得。在本专利技术的另一方面，还提供了一种多克隆抗体，该多克隆抗体是用上述重组蛋白免疫兔子而制得。在本专利技术的另一方面，还提供了一种上述柔嫩艾美耳球虫基因的应用，用于制备预防或治疗鸡球虫病的疫苗或药物。优选的，本专利技术提供一种防治鸡球虫病的疫苗的制备方法：将柔嫩艾美耳球虫EtSTK的成熟肽与真核表达载体相连获重组真核表达质粒，经肌肉注射免疫后，鸡只可获得比较好的免疫保护力。所述疫苗或药物通过抑制柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵宿主细胞而阻断球虫生活史来发挥作用。在本专利技术的另一方面，还提供了一种上述柔嫩艾美耳球虫基因的应用，用于筛选预防或治疗球虫病的药物。在本专利技术的另一方面，还提供了一种疫苗，包含上述重组蛋白，或上述重组载体，该重组载体为真核表达载体。在本专利技术的另一方面，还提供了一种作用靶标为EtSTK蛋白的抗球虫药物。本专利技术柔嫩艾美耳球虫保守蛋白EtSTK基因，是柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)的一个新基因。Western-blot分析表明本专利技术EtSTK的原核表达产物和真核表达产物都具有良好的免疫原性；免疫荧光定位实验和体外抑制试验结果显示EtSTK与子孢子的入侵相关，在球虫子孢子入侵宿主细胞时发挥了重要作用。因此，本专利技术的EtSTK基因，为开发抑制子孢子入侵、阻断球虫生活史的新疫苗或新药提供了新思路。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。图1是本专利技术实施例1柔嫩艾美耳球虫EtSTK基因扩增产物电泳鉴定图；M：标准DNA分子量(从上到下：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)。图2是本专利技术实施例2实时定量PCR检测EtSTK基因在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段的转录水平图；图3是本专利技术实施例3重组原核表达质粒pColdI-EtSTK的双酶切鉴定图；“1”代表重组表达质粒pcoldI-EtSTK的BamHI、EcoRI双酶切产物。图4是本专利技术实施例3纯化的EtSTK重组蛋白分析图；M：蛋白质标准分子量(从上至下为：170kDa、130kDa、95kDa、72kDa、55kD本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种柔嫩艾美耳球虫基因，其特征在于，所述基因为Et STK基因，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种柔嫩艾美耳球虫基因，其特征在于，所述基因为EtSTK基因，其氨基酸序列如
SEQIDNO.1所示。
2.一种编码柔嫩艾美耳球虫基因的多核苷酸，其特征在于，所述基因为EtSTK基因，其
氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
3.一种含有编码柔嫩艾美耳球虫基因的多核苷酸的DNA分子，其全长核苷酸序列如SEQ
IDNO.2所示。
4.一种重组载体，其特征在于，包含编码EtSTK蛋白氨基酸序列的核苷酸序列，所述Et
STK蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。
5.一种重组蛋白，其特征在于，该重组蛋白是由权利要求3所述重组载体经表达而制
得。
【专利技术属性】
技术研发人员：董辉，黄兵，朱雪龙，韩红玉，赵其平，朱顺海，李聪，王自文，门启斐，夏伟丽，杨致远，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31
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