一种IV型胶原蛋白测试试剂盒及其测试方法技术

本发明专利技术公开了一种IV型胶原蛋白的测试试剂盒，该试剂盒由磁分离试剂，试剂R1，试剂R2，标准品、质控品，校准品，清洗浓缩液、稀释液及发光底物组成，本发明专利技术还公开了该试剂盒的制备方法。本发明专利技术试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系，与现有酶联免疫的技术相比，本发明专利技术具有更高的特异性，灵敏度，获得检测结果的时间短，操作方式简便，检测结果准确可靠，大大降低了产品成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，尤其涉及测定血清中IV型胶原蛋白含量的试剂盒及其测试方法。
技术介绍
IV型胶原(CollagenTypeIV，简写为CIV)是由分子交联形成的一种网状结构，它有两个末端，7s胶原组分为IV型胶原氨基末端的四聚体，NC1为IV型胶原羧基末端的二聚体，均参与寡聚体的形成。IV型胶原是肝基底膜的主要成分，存在于肝门静脉血管区，中央静脉周围，沿着窦状隙分布。IV型胶原在合成代谢过程中不需去除端肽而沉积于细胞外基质，故血中IV型胶原的含量升高可能反映了肝血窦基底膜的更新率加快。基础和临床研究均发现血清IV型胶原水平和肝纤维化及门脉高压程度密切相关，与肝脏炎症活动关系较小。正常肝脏的肝窦周围无完整的基底膜结构。肝纤维化时，Disse氏腔内形成基底膜。此时，肝组织及血清中IV型胶原含量亦相应增加，且IV型胶原含量与肝纤维化程度呈正相关。因此，测定血清中IV型胶原含量是辅助诊断肝纤维化的一个重要指标。除了对肝纤维化进行辅助诊断，血清IV型胶原是判断糖尿病早期肾损害或肾小球纤维化程度的有用指标；同时对探讨肺结核发生肺纤维化的早期诊断、以及发病机理的研究等也具有重要意义。临床检测IV型胶原一般采用放射免疫分析方法、固相酶联免疫方法或时间分辨荧光免疫分析方法。放射免疫分析法存在操作复杂、测定结果不稳定、试剂保存时间短、放射性污染、仪器昂贵等问题；时间分辨荧光免疫分析方法需要用稀有金属进行标记；化学发光仅能一次发光且易受环境干扰；酶联免疫方法特异性好和灵敏性高、操作简便、试剂稳定、对环境没有污染威胁。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种特异性强，灵敏度高，获得检测结果的时间短，操作方式简便，检测结果准备可靠的IV型胶原蛋白(IV-COL)的测试试剂盒及其测试方法。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种IV型胶原蛋白检测试剂盒，包括：磁分离试剂、试剂R1、试剂R2、清洗浓缩液和发光底物，其中：所述磁分离试剂中含有标记有小鼠抗人IV-COL的单克隆抗体的纳米磁性微球；所述试剂R1中含有碱性磷酸酶标记的IV-COL抗体；所述试剂R2中含有牛γ球蛋白IgG；所述清洗浓缩液中含有Tween-20；所述稀释液中含有BSA；所述发光底物中含有IUMIPHOS530。在本专利技术中，磁分离试剂中标记有小鼠抗人IV-COL的单克隆抗体的纳米磁性微球的浓度为100～200μg/mL。在实施例中，标记有小鼠抗人IV-COL的单克隆抗体的纳米磁性微球的浓度为132～167μg/mL。在一些实施例中，标记有小鼠抗人IV-COL的单克隆抗体的纳米磁性微球的浓度为132μg/mL。在此实施例中，磁分离试剂中包括：标记有小鼠抗人IV-COL的单克隆抗体的纳米磁性微球132μg/mL；BSAV3g/L；TRIS4.58g/L；NaCl6.81g/L；Tween200.96g/L；Proclin3000.2mL/L。在另一实施例中，标记有小鼠抗人IV-COL的单克隆抗体的纳米磁性微球的浓度为167μg/mL。在此实施例中，磁分离试剂中包括：标记有小鼠抗人IV-COL的单克隆抗体的纳米磁性微球167μg/mL；BSAV3g/L；TRIS4.58g/L；NaCl6.81g/L；Tween200.96g/L；Proclin3000.2mL/L。磁分离试剂的pH值为8.0±0.05。磁分离试剂中标记有小鼠抗人IV-COL的单克隆抗体的纳米磁性微球的制备方法为：(1)将DSS(辛二酸二琥珀酰亚胺)溶于DMSO中至浓度为20mg/mL，记为溶液1；将IV-COL抗体溶于pH值为9.5的0.1mol/LPB缓冲液中至浓度为2mg/ml，记为溶液2；(2)溶液1与溶液2混合，置室温90min，记为溶液3；(3)将溶液3加入到Centricon-10浓缩管中,3000g离心30min至体积为0.5ml，记为抗体溶液；(4)取0.5mL磁珠经磁铁吸附2分钟后吸取上清；以pH值为9.5的0.1mol/LPB缓冲液清洗3次；(5)抗体溶液与磁珠混合，室温反应4小时，保持混匀状态；(6)加入1mol/L的Tris溶液37℃孵育15分钟，获得标记的磁珠；其中Tris的加样量为1mg抗体加0.15mlTris；(7)以pH7.20.1mol/LPB清洗标记的磁珠3次，获得标记有小鼠抗人IV-COL的单克隆抗体的纳米磁性微球。本专利技术采用的IV-COL抗体为IV-COL的单克隆抗体，本专利技术对其来源不做限定，其可为自制也可于市场购得，其实施皆在本专利技术的保护范围之内。本专利技术采用的IV-COL单克隆抗体来自北京菲斯特生物科技有限公司。本专利技术采用的磁珠为四氧化三铁微球，其直径为0.01～5.0μm。在本专利技术中，试剂R1中碱性磷酸酶标记的IV-COL抗体的浓度为0.5～2μg/mL。在实施例中，碱性磷酸酶标记的IV-COL抗体的浓度为0.6～1μg/mL。在一些实施例中，碱性磷酸酶标记的IV-COL抗体的浓度为0.6μg/mL。在此实施例中，试剂R1中包括：碱性磷酸酶标记的IV-COL抗体0.6μg/mL；BSAV3g/L；TRIS6.06g/L；NaCl13.0g/L；Proclin3000.2mL/L；MgCl20.05g/L；Zncl20.05g/L。在另一实施例中，碱性磷酸酶标记的IV-COL抗体的浓度为1μg/mL。在此实施例中，试剂R1中包括：碱性磷酸酶标记的IV-COL抗体1μg/mL；BSAV3g/L；TRIS6.06g/L；NaCl13.0g/L；Proclin3000.2mL/L；MgCl20.05g/L；Zncl20.05g/L。试剂R1的pH值为7.4±0.05。碱性磷酸酶标记的IV-COL抗体的制备方法为：(1)将ALP溶解于生理盐水，至浓度为2mg/mL，加入到Centricon-10浓缩管中，3000rpm离心大约20分钟，获得ALP溶液；(2)每毫升ALP溶液加入0.2ml的0.1MNaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟后，装入透析袋中，用1mMpH值为4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜，获得醛化ALP；(3)每毫升加20μl0.2MpH值为9.5的碳酸盐缓冲液，使pH值为9.0～9.5，加入IV-COL的I本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种IV型胶原蛋白检测试剂盒，包括：磁分离试剂、试剂R1、试剂R2、清洗浓缩液、稀释液和发光底物，其中：所述磁分离试剂中含有标记有小鼠抗人IV‑COL的单克隆抗体的纳米磁性微球；所述试剂R1中含有碱性磷酸酶标记的IV‑COL抗体；所述试剂R2中含有牛γ球蛋白IgG；所述清洗浓缩液中含有Tween‑20；所述稀释液中含有BSA；所述发光底物中含有IUMIPHOS530。

【技术特征摘要】
1.一种IV型胶原蛋白检测试剂盒，包括：磁分离试剂、试剂R1、试剂
R2、清洗浓缩液、稀释液和发光底物，其中：
所述磁分离试剂中含有标记有小鼠抗人IV-COL的单克隆抗体的纳米磁
性微球；
所述试剂R1中含有碱性磷酸酶标记的IV-COL抗体；
所述试剂R2中含有牛γ球蛋白IgG；
所述清洗浓缩液中含有Tween-20；
所述稀释液中含有BSA；
所述发光底物中含有IUMIPHOS530。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述磁分离试剂中标记
有小鼠抗人IV-COL的单克隆抗体的纳米磁性微球的浓度为100～200μg/mL。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中碱性磷
酸酶标记的IV-COL抗体的浓度为0.5～2μg/mL。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中牛γ球
蛋白IgG0.9μg/mL；TRIS1.56g/L；NaCl4.23g/L；Proclin0.2mL/L。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述清洗浓缩液中包括：
TRIS12.54g/L；NaCl325.6g/L；Twe...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱驰，
申请(专利权)人：北京豪迈生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11