新型抗-Fc-γ受体IIB抗体及其用途制造技术

本发明专利技术提供一种抗-FcγRIIB抗体，与现有技术抗体相比，其显著地增强了FcγRIIB的ITIM磷酸化并因此能够用于自身免疫性疾病的治疗或预防。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
作为蛋白质的免疫球蛋白基因超级家族的成员，FcγRII受体是由两个细胞外免疫球蛋白结构域、一个单跨膜结构域和一个长度变化的胞浆结构域组成的单一多肽链40kDa完整膜结合的糖蛋白。FcγRII受体在多种造血细胞上表达，是人血小板和巨核细胞上的唯一Fc-受体(Cassel,McKenzie,1993)。已知人的三种FcγRII受体，FcγRIIA、FcγRIIB和FcγRIIC，它们均结合IgG(例如以1-2x106M-1的亲和性结合IgG1)或免疫复合物(IC，例如IgG调理的病原体)。FcγRIIA和FcγRIIB主要由于胞质结构域中的差异而互不相同，所述差异最终导致受体连接后的功能性异质反应。FcγRIIA触发导致细胞的活化(例如吞噬作用和呼吸爆发)，而FcγRIIB起始抑制性信号，从而导致例如B细胞活化的抑制。FcγRIIC与FcγRIIB共享胞外结构域，与FcγRIIA共享胞质结构域，从而在结合IgG或IC后传递活化信号。FcγRIIB在除T细胞和NK细胞以外的所有白细胞上表达，是在人B细胞上表达的唯一的抑制性Fc受体。单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞共表达活化的FcγRIIA，而抑制性FcγRIIB受体和FcγRIIC在自然杀伤细胞(NK细胞)上表达并构成该类细胞上的唯一FcγR。已知FcγRIIB的两种在生物学功能不同的同种型。FcγRIIB-1唯一地在B细胞上表达，而发现在IC结合后引起内吞-/吞噬作用诱导的FcγRIIB-2在所有其他FcγRIIB表达细胞上表达(Nimmerjahn,Ravetch,2008)。FcγRIIB在胞外区中与FcγRIIA享有93％的同源性。如上所述，FcγRIIB与FcγRIIA之间的主要差异存在于胞质结构域。FcγRIIB包含ITIM(基于免疫受体酪氨酸的抑制基序)，而FcγRIIA包含ITAM(基于免疫受体酪氨酸的活化基序)。通过IC结合的FcγRIIA簇集引起ITAM基序与引发ITAM基序(共有序列：Y-X2-L/I-X8-Y-X2-L/I，Isakov，1997)中酪氨酸残基磷酸化的受体相关激酶的共定位以及随后与激酶Syk相互作用，所述激酶Syk通过大量下游信号传导和基因活化事件来引发细胞的活化(Ghazizadeh等,1994)。结合活性FcγRIIA的免疫球蛋白引起促炎性反应，该促炎性反应随后导致病原体的去除，但在自身抗体的情况下，还可导致健康组织的破坏，从而达到病理性自体免疫疾病峰。因此，需要对抗体特异性的严格控制和否定性反馈系统来避免免疫系统对机体的异常破坏。所述抑制性FcγRIIB受体就是该否定性反馈系统的一部分。FcγRIIB的特征在于在胞质结构域中存在ITIM基序(共有序列：V/I-X-Y-X2-V/L，Isakov，1997)，其在Ig-聚集体或IC结合和与携带ITAM的活化Fcγ受体共连接后被激酶Lyn磷酸化。经磷酸化的ITIM吸引多磷酸肌醇5’-磷酸酶的SH2-结构域(SHIP)，SHIP转而水解磷酸肌醇信使，所述磷酸肌醇信使由于含ITAM的FcγR-介导的酪氨酸激酶活化而释放，因而阻止细胞内Ca2+的流入。FcγRIIB交联抑制对FcγR连接的活化反应，其继而抑制B细胞活化、增殖和抗体分泌。FcγRIIB具有两种抑制活性。如上所述，其一依赖于ITIM基序并在FcγRIIB连接到携带ITAM的受体(例如FcγRIIA)时发生，导致ITAM触发的钙动员和细胞增殖的抑制。这就意味着诸如脱粒作用、吞噬作用、ADCC、细胞因子释放和促炎活化的钙依赖性过程以及B细胞增殖都被FcγRIIB阻断。FcγRIIB的第二种抑制活性包括B细胞上受体的同型聚集(FcγRIIB簇集)。同型聚集将促细胞凋亡信号递送到细胞质中，这可被FcγRIIB与B细胞受体(BCR)的连接所阻断。多价-抗原结合后的BCR信号传导的特征在于簇集的BCR通过Lyn(Src家族的一种激酶)磷酸化。这种Lyn作用下的磷酸化与BCR和被称作“脂筏”的富含鞘脂和胆固醇的膜微结构域的联合一起发生。这些不溶的“脂筏”在免疫突触的形成中起着重要作用。已观察到，BCR与APC(抗原提呈细胞)上的抗原的相互作用致使在所接合的B细胞和APC的界面处形成该免疫突触。FcγRIIB与BCR的共连接使BCR与脂筏的联合去稳定，随后阻断B细胞的免疫突触的形成。BCR信号传导的FcγRIIB抑制包含受体的细胞质结构域的ITIM中的酪氨酸残基被激酶Lyn磷酸化以及随后的肌醇磷酸酶SHIP的募集(Daeron等.,1995,RavetchandBolland,2001)。科学界接受这样的观点：FcγRIIB可被看作外周B细胞发育过程中较晚检查点(checkpoint)，并且其还直接调节浆细胞存活。因此FcγRIIB被认为是用于治疗B细胞障碍、特别是B细胞介导的免疫反应的重要靶标。在小鼠和人中的研究已经阐明FcγRIIB对B细胞活性和体液耐受的影响，其中FcγRIIB表达的降低或缺少造成了明显的自身免疫性疾病的发展或加剧。事实上，FcγRIIB在诸如原发免疫性血小板减少症、全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎(RA)、大疱性天疱疮、寻常型天疱疮和其他天疱疮形式、B细胞驱动的多发性硬化症的自身免疫性疾病以及其他以病原性免疫复合物发展为特征的自身免疫性疾病的发展和过程中起到关键作用。在健康个体的免疫反应期间，已经进入血液循环的病原体受到针对病原体生物体的表位的抗体(免疫球蛋白，Ig)的调理，并继而导致所谓的免疫复合物的形成。这些免疫复合物随后会被免疫系统的特定细胞(如巨噬细胞、中性粒细胞、吞噬细胞)所吞噬，这导致病原体生物体从血液循环中被清除。另外已经证明，FcγRIIB在外周耐受性方面也起着关键作用，因为FcγRIIB敲除小鼠发展自发的自身免疫性疾病。FcγRIIB不足导致对诱发的自身免疫性疾病的易感性(Bolland和Ravetch，2000)。与健康人相比，在遭受自身免疫性疾病的患者中，FcγRIIB在B细胞上的表达通常会减弱或降低。然而例如幼稚B细胞显示出正常的FcγRIIB表达，来自RA患者的记忆B细胞和浆母细胞则显示出这一受体的表达降低(Catalán，2010)。Xiang及同事也能够表明，在来自健康捐赠者的浆母细胞上通过表面耦合的抗-FcγRIIB抗体2.4G2的FcγRIIB交联导致细胞凋亡(Xiang等，2007)基于上述的FcγRIIB在自身免疫性疾病中的显著作用，已经开发了针对该受体的抗体，以便治疗或诊断患者。WO2009/08本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗FcγRIIB抗体，所述抗体包含：(i)与SEQ ID NO.20中所示的H‑CDR1序列具有60％或更多同一性的H‑CDR1序列，(ii)与SEQ ID NO.21中所示的H‑CDR2序列具有36％或更多同一性的H‑CDR2序列，(iii)与SEQ ID NO.22中所示的H‑CDR3序列具有50％或更多同一性的H‑CDR3序列，(iv)与SEQ ID NO.23中所示的L‑CDR1序列具有64％或更多同一性的L‑CDR1序列，(v)与SEQ ID NO.24中所示的L‑CDR2序列具有29％或更多同一性的L‑CDR2序列，和(vi)与SEQ ID NO.25中所示的L‑CDR3序列具有78％或更多同一性的L‑CDR3序列，其中，相比于未经所述抗体处理的Daudi细胞，所述抗体使Daudi细胞的FcγRIIB的ITIM磷酸化增强约4至10倍。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.08.16 EP 13004094.21.一种抗FcγRIIB抗体，所述抗体包含：
(i)与SEQIDNO.20中所示的H-CDR1序列具有60％或更多同一性的H-CDR1序列，
(ii)与SEQIDNO.21中所示的H-CDR2序列具有36％或更多同一性的H-CDR2序列，
(iii)与SEQIDNO.22中所示的H-CDR3序列具有50％或更多同一性的H-CDR3序列，
(iv)与SEQIDNO.23中所示的L-CDR1序列具有64％或更多同一性的L-CDR1序列，
(v)与SEQIDNO.24中所示的L-CDR2序列具有29％或更多同一性的L-CDR2序列，和
(vi)与SEQIDNO.25中所示的L-CDR3序列具有78％或更多同一性的L-CDR3序列，
其中，相比于未经所述抗体处理的Daudi细胞，所述抗体使Daudi细胞的FcγRIIB的
ITIM磷酸化增强约4至10倍。
2.根据权利要求1所述的抗体，所述抗体在其重链可变区中包含SEQIDNOs.29、30和
31中所示的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3，并且在其轻链可变区中包含SEQIDNOs.32、33和34
中所示的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3，其中与未经所述抗体处理的Daudi细胞相比，所述抗体
使Daudi细胞的FcγRIIB的ITIM磷酸化增强约4至10倍。
3.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，所述抗体
(a)在其重链可变区中包含SEQIDNOs.14、15和16中所示的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3，
并且在其轻链可变区中包含SEQIDNOs.17、18和19中所示的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3；或
者
(b)在其重链可变区中包含SEQIDNOs.20、21和22中所示的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3，
并且在其轻链可变区中包含SEQIDNOs.23、24和25中所示的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3，
其中与未经所述抗体处理的Daudi细胞相比，所述抗体使Daudi细胞的FcγRIIB的ITIM
磷酸化增强约4至10倍。
4.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，所述抗体是嵌合的或人源化的。
5.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述重链可变区包含SEQIDNO.3中
所示的氨基酸序列，并具有选自下述的突变中的至少一个：位置1处的氨基酸Q被E替代，位
置11处的氨基酸V被L替代，位置42处的氨基酸G被K替代，位置50处的氨基酸S被V替代，位置
53处的氨基酸Y被S替代，位置58处的氨基酸K被T替代，位置61处的氨基酸G被A替代，位置75
处的氨基酸S被T替代，位置76处的氨基酸K被R替代，位置77处的氨基酸N被S替代，和位置78
处的氨基酸T被N替代。
6.根据前述权利要求中任一项所述的抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·松德尔曼，T·波尔，D·特米尔，A·卡尔，D·埃哈尔特，N·里特，
申请(专利权)人：苏伯利莫尔公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE