一种丙氨环丙沙星半抗原及其制备方法和用途技术

本发明专利技术提供了一种环丙沙星半抗原及其制备方法和用途，以及以此环丙沙星半抗原制备的环丙沙星抗原。将该环丙沙星抗原免疫新西兰兔，可得到高特异性的抗体。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物化工
，具体涉及一种环丙沙星抗原的制备方法及其应用。
技术介绍
环丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)属于第三代氟喹诺酮类药物，是一种常用广谱抗生素类药物，常作为抗菌剂广泛地应用于畜禽细菌性传染病的预防及治疗。但过量使用或滥用可导致该药物在动物源性食品中残留，从而对人类健康造成严重的威胁。因此世界各国对环丙沙星以及其他氟喹诺酮类药物的的残留限量越来越严格，我国农业部最新修订的《动物性中食品中兽药最高残留限量》中规定牛、羊等的奶中及所有食品动物的肌肉、脂肪、肝、肾脏中所有环丙沙星药物的最高残留限量100ppb。目前，应用于环丙沙星与其他喹诺酮类药物检测的常用方法有高效液相色谱(HPLC)、GC/MS、LC/MS与ELISA。免疫分析具有灵敏、快速、操作简单、特异性高的特点，在高通量药物残留筛选
占据极为重要的地位。而免疫分析方法过程中，抗原的制备又是最为关键的一个步骤。由于环丙沙星分子量较小，必须将其与载体偶联形成完全抗原后才能制备相应抗体，因此，合成高质量的免疫原是小分子物质免疫分析的关键。合成免疫原一般采用化学方法使半抗原与载体蛋白偶联
技术实现思路
本专利技术提供了式(I)所示的丙氨环丙沙星化合物、其制备方法、以及式(I)化合物作为半抗原/中间体，以用于制备环丙沙星包被抗原的用途和方法。具体公开了式(I)化合物的制备方法包含以下步骤：(1)取盐酸环丙沙星0.33g，溶于10mlN,N‐二甲基甲酰胺溶液中，80℃搅拌；(2)逐滴加入氢溴酸3‐溴丙氨0.26g，80℃搅拌3h；(3)将步骤(2)制备得到的反应液减压蒸馏，得到式(I)化合物。以及进一步的，通过制备液相色谱对式(I)进行纯化的方法；其中制备液相色谱的色谱条件为色谱柱尺寸为150mm×4.6mm，色谱柱的固定相填充颗粒的粒径为3.5um；流动相流速1.0mL/min，柱温40℃；所述制备色谱色谱的流动相为乙腈的三氟乙酸水溶液的梯度溶液：以体积百分比计，1‐9分钟为5％—95％的乙腈的三氟乙酸水溶液的梯度溶液，9‐14分钟为95％的乙腈的三氟乙酸水溶液，14‐15分钟为95％—5％的乙腈的三氟乙酸水溶液的梯度溶液，其中所述三氟乙酸水溶液为含体积浓度0.01％的三氟乙酸的水溶液；收集制备液相色谱柱的流出液,得纯化的式(I)化合物。本专利技术公开了式(I)化合物用于制备环丙沙星包被抗原的用途，即作为制备环丙沙星包被抗原的中间体，或者作为制备环丙沙星包被抗原的半抗原，以制备环丙沙星-丙氨-牛血清蛋白、环丙沙星-丙氨-卵清蛋白的用途。具体的，本专利技术所述的式(I)化合物制备环丙沙星-丙氨-牛血清蛋白或环丙沙星-丙氨-牛血清蛋白抗原的用途，在于所述制备方法包含以下步骤：(1)取式(I)化合物0.10g，溶于5mL0.6mol/L的盐酸溶液中，加入30mg锌粉，80℃水浴锅加热30min，得溶液A；(2)称取100mg牛血清蛋白溶解于2mL的0.02mol/L的磷酸盐缓冲液中，得溶液B；(3)将溶液A缓慢滴加到溶液B中充分混合，滴加体积浓度25％的戊二醛水溶液0.1ml，室温搅拌6小时；混合液装入透析袋，PH值7.4的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液液4℃透析72小时，得环丙沙星‐丙氨‐牛血清蛋白。同时，本专利技术提供了一种制备环丙沙星‐丙氨‐牛血清蛋白的方法，包含以下步骤：(1)取式(I)化合物0.10g，溶于5mL0.6mol/L的盐酸溶液中，加入30mg锌粉，80℃水浴锅加热30min，得溶液A；(2)称取100mg牛血清蛋白溶解于2mL的0.02mol/L的磷酸盐缓冲液中，得溶液B；(3)将溶液A缓慢滴加到溶液B中充分混合，滴加体积浓度25％的戊二醛水溶液0.1ml，室温搅拌6小时；混合液装入透析袋，PH值7.4的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液液4℃透析72小时，得环丙沙星‐丙氨‐牛血清蛋白。进一步的，本专利技术公开了上述制备方法得到的环丙沙星‐丙氨‐牛血清蛋白产品，及环丙沙星‐丙氨‐牛血清蛋白包被抗原；以及以所述环丙沙星‐丙氨‐卵清蛋白作为抗原免疫新西兰兔制备环丙沙星抗体、进而制备环丙沙星检测试剂盒的用途。此外，本专利技术还具体的提供了所述的式(I)化合物制备环丙沙星-丙氨-卵清蛋白或环丙沙星-丙氨-卵清蛋白抗原的用途，在于所述制备方法包含以下步骤：(1)式(I)化合物0.10g，溶于N，N‐二甲基甲酰胺，得溶液C；(2)取1‐(3‐二甲氨基丙基)‐3‐乙基碳二亚胺盐酸盐30mg，溶于4mL蒸馏水，缓慢滴加至溶液C中，室温搅拌24小时，得溶液D；(3)将步骤(2)制备的溶液D离心，取上清液，缓慢滴加至5mL含50mg卵清蛋白的碳酸钠缓冲水溶液中，所述碳酸钠缓冲水溶液的浓度为0.1mol/L，4℃搅拌72小时，得环丙沙星‐丙氨‐卵清蛋白。同时，本专利技术提供了一种制备环丙沙星‐丙氨‐卵清蛋白的制备方法，包含以下步骤：(1)式(I)化合物0.10g，溶于N，N‐二甲基甲酰胺，得溶液C；(2)取1‐(3‐二甲氨基丙基)‐3‐乙基碳二亚胺盐酸盐30mg，溶于4mL蒸馏水，缓慢滴加至溶液C中，室温搅拌24小时，得溶液D；(3)将步骤(2)制备的溶液D离心，取上清液，缓慢滴加至5mL含50mg卵清蛋白的碳酸钠缓冲水溶液中，所述碳酸钠缓冲水溶液的浓度为0.1mol/L，4℃搅拌72小时，得环丙沙星‐丙氨‐卵清蛋白。进一步的，本专利技术公开了上述制备方法得到的环丙沙星‐丙氨‐卵清蛋白，或作为环丙沙星‐丙氨‐卵清蛋白抗原和环丙沙星‐丙氨‐卵清蛋白包被抗原；以及以所述环丙沙星‐丙氨‐卵清蛋白作为抗原免疫新西兰兔制备环丙沙星抗体，进而制备环丙沙星检测试剂盒的用途。本专利技术合成了丙氨环丙沙星半抗原，经过ESI‐MS、IR和1H‐NMR与13C‐NMR对合成的半抗原进行了确证，为进一步建立的ELISA检测方法提供了必要的半抗原结构信息。该半抗原可利用其远离抗原决定簇结合位点的‐NH2与蛋白载体上氨基的偶联，制备出理想的人工抗原。同时，本专利技术合成了环丙沙星‐丙氨‐卵清蛋白抗原，以及环丙沙星‐丙氨‐牛血清蛋白抗原，并通过紫外吸收光谱法鉴定了结构。可将本专利技术制备的人工抗原免疫新西兰白兔，获得环丙沙星抗体，以制备环丙沙星检测试剂盒。抗体通常对远离联结位点的半抗原部分具有较好的识别能力，因此半抗原与载体蛋白的偶联位置最好远离重要的抗原决定簇。环丙沙星母环上的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种如下式(I)所示的丙氨环丙沙星化合物：

【技术特征摘要】
1.一种如下式(I)所示的丙氨环丙沙星化合物：
2.一种式(I)化合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)取盐酸环丙沙星0.33g，溶于10mlN,N‐二甲基甲酰胺溶液中，80℃搅拌；
(2)逐滴加入氢溴酸3‐溴丙氨0.26g，80℃搅拌3h；
(3)将步骤(2)制备得到的反应液减压蒸馏，得到式(I)化合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤还包括：通过制备液
相色谱，纯化式(I)化合物；
其中所述制备液相色谱的色谱柱尺寸为150mm×4.6mm，色谱柱的固定相
填充颗粒的粒径为3.5um；流动相流速1.0mL/min，柱温40℃；
所述制备色谱色谱的流动相为乙腈的三氟乙酸水溶液的梯度溶液：以体积
百分比计，1‐9分钟为5％—95％的乙腈的三氟乙酸水溶液的梯度溶液，9‐14分钟
为95％的乙腈的三氟乙酸水溶液，14‐15分钟为95％—5％的乙腈的三氟乙酸水溶
液的梯度溶液，其中所述三氟乙酸水溶液为含体积浓度0.01％的三氟乙酸的水溶
液；收集制备液相色谱柱的流出液,得纯化的式(I)化合物。
4.式(I)化合物用于制备环丙沙星抗原的用途。
5.一种制备环丙沙星‐丙氨‐牛血清蛋白的方法，包含以下步骤：
(1)取式(I)化合物0.10g，溶于5mL0.6mol/L的盐酸溶液中，加入30mg锌
粉，80℃水浴锅加热30min，得溶液A；
(2...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯亭亭，魏东，李永民，庞永宏，范建国，郭芬芳，孙慧芝，张爱峰，李续俊，梁建飞，
申请(专利权)人：河北北方学院，
类型：发明
国别省市：河北;13