一种丙二酰基人参皂苷的含量测定方法技术

一种无对照品而准确测定丙二酰基人参皂苷的含量测定方法，通过阀切换从高效液相色谱流出组分中收集待测样品中含丙二酰基人参皂苷的组分，将该组分水解获得其水解产物，测定上述水解产物中相应的中性人参皂苷含量，其与待测样品中丙二酰基人参皂苷的物质的量相等，进而换算出样品中丙二酰基人参皂苷的含量。该方法简单、快速，测定结果精密度、准确度高，可用于样品中丙二酰基人参皂苷的定性定量分析及质量控制。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于药物分析方法领域，涉及丙二酰基人参皂苷的含量测定方法，特别的，涉及一种柱切换高效液相色谱法测定丙二酰基人参皂苷的含量测定方法。
技术介绍
对照品是化学定量分析中测量化学成分量值的基本参照，在药物分析中具有重要意义。然而，很多化学成分难以获得足够的对照品，或者其对照品因为理化性质不稳定难以保存，这种情况下很难测量该化学成分的准确量值。丙二酰基人参皂苷(malonyl-ginsenoside)称为丙二酸单酰基人参皂苷，在鲜人参及其药材中含量很高，其中，鲜参中丙二酰基人参皂苷含量比中性人参皂苷高很多，生晒参中丙二酰基人参皂苷含量略高于中性人参皂苷。是一类极性大，亲水性强，极易溶于水的酸性皂苷，该类化合物分子中酰基键极不稳定，很容易水解，遇酸、碱或在热水、热甲醇条件下都会发生水解反应脱去丙二酸，成为相应的人参皂苷。研究发现人参中，以丙二酰基人参皂苷M-Rb1、M-Rb2、M-Rc为主，具有降糖活性，能降低糖尿病模型小鼠血糖，促进肝糖元合成。丙二酰基人参皂苷Rb1具有促进小鼠齿状突长时呈增效作用，对神经生长因子诱导外培养鸡胚的背根神经突的外生长有增强作用。由此可见，准确测定人参及其制品中各类丙二酰基人参皂苷的含量对于评价人参产品的品质，指导临床用途有重要的意义。现有技术中一般采用差值法估算人参中的丙二酰基人参皂苷的含量，即先测定人参中中性人参皂苷的含量，然后将人参提取物用碱水解，测定水解后样品中中性人参皂苷的含量，减除水解前样品中相应的中性人参皂苷的含量，差值为相应的丙二酰基人参皂苷的含量。这一方法的缺点在于，第一，水解产生相同中性人参皂苷的丙二酰基人参皂苷类物质至少两种，可能很多种，因此无法测定每一种丙二酰基人参皂苷的含量；第二，由于丙二酰基人参皂苷化学性质不稳定，因此其对照品无法长时间保存和运输；第三，常温下这一类化合物在溶液中稳定时间不足6小时，用其本身作为对照品难以完成常规测试过程中的方法学考察，无法确定数据的可靠性。而现有技术中的检测方法均不能解决上述技术缺陷。因此，开发一种行之有效的检测方法测定丙二酰基人参皂苷的含量极为重要。
技术实现思路
为填补现有技术的空白，本专利技术旨在提供一种能够准确测定人参及其制品中不同丙二酰基人参皂苷含量的方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的,具体为：1)取含丙二酰基人参皂苷的组分B，将其水解获得水解产物C，包括由丙二酰基人参皂苷水解产生的中性人参皂苷；2)测定步骤1)中所得中性人参皂苷的含量D；3)根据D计算组分B中丙二酰基人参皂苷的含量。优选的，步骤1)中，所述水解方法为碱溶液水解法。进一步优选的，碱溶液选自氢氧化钠或氢氧化钾水溶液，浓度为0.1～0.5M，水解液温度为60～90℃，水解时间4～10min。进一步优选的，水解的具体步骤为，先在线将组分B其富集于固相萃取小柱，然后向固相萃取小柱中通入碱溶液而进行水解。更优选的，所述的富集方法为，采用阀切换法在线将丙二酰基人参皂苷吸附于固相萃取小柱上；优选的，阀切换法的具体操作为，使丙二酰基人参皂苷组分B的洗脱组分通过固相萃取富集柱，同时通过泵添加调节剂改变流出组分的溶剂组成，使含丙二酰基人参皂苷组分B和其它成分完全吸附于富集柱上，再次通过阀切换，将碱溶液泵入富集柱中，使丙二酰基人参皂苷的丙二酰基水解,获得水解产物C。更优选的，采用阀切换法富集皂苷的富集条件为，富集柱填料为聚乙烯苯树脂，具体规格：粒径30～50um、填料用量10～30mg、内径1/8～1/16英寸，修饰剂为纯水，流速0.1～0.5mL/min。优选的，步骤2)中的具体测定方法为，将步骤1)中所述的固相萃取小柱直接连接于色谱柱的前端进行色谱分析，测定水解产物C中相应的中性人参皂苷含量D；优选的，所述链接方式为串联法。进一步优选的，所述步骤2)中，具体的测定方法为，①水解结束后，通过阀切换，清洗管路和富集柱中的碱溶液，②再次通过阀切换，记录丙二酰基人参皂苷水解产生的相应中性人参皂苷D的仪器型号响应值A1，③再将对照品中性人参皂苷进样，记录其响应值A2，④将响应值A1与A2进行比较，计算水解产生的中性人参皂苷D的含量。优选的，所述待测样品B的制备方法为，取鲜人参匀浆0.1～5g，精密称定，加入甲醇10～50mL，超声处理10～30min后置于0-4℃冰箱中放置过夜。使用前充分混合，取1～10mL悬浮液，离心10-30min，取上清液，经色谱法分离即得。另外，本专利技术还提供上述含量测定方法在丙二酰基人参皂苷定性分析中的应用。具体的，本专利技术还利用上述含量测定方法，鉴定了未知结构的丙二酰基人参皂苷。具体鉴定方法如下：参见图2可知，图2为8年生鲜人参中丙二酰基人参皂苷Rf(以下简称为mRf)的定量分析色谱图，图2A表示人参总提取物的色谱图；图2B表示从总提物中在线富集的含有丙二酰基人参皂苷1的组分的总离子流色谱图，其中化合物1结构未知；图2C表示将化合物1水解后，所得产物的总离子流色谱图，2、3均为单一的化合物。另外，参见图4可知，化合物1为丙二酰基人参皂苷，但是由于E06和E05质谱规律相同，因此，无法确定其母核为人参皂苷Rg1或人参皂苷Rf，而用对照品比较可知，图2中化合物2、3分别为人参皂苷Rg1和人参皂苷Rf，因此就间接推知化合物1为丙二酰基人参皂苷Rf，即确定了其结构。因此，本专利技术的有益效果是显而易见的。本专利技术先将不同丙二酰基人参皂苷类物质分离，直接在线富集于固相萃取小柱上，采用温和的碱水解条件在柱上进行水解，然后将萃取小柱直接串联到色谱柱上进行分析，整个过程无样品损失(富集过程回收率为99.48±1.25％(mRe)，水解过程回收率为99.67±0.66％)，分析结果精密度高(RSD＝0.92％)。不仅可以分别对不同的丙二酰基人参皂苷进行定量，而且可用于鉴定未知结构的丙二酰基人参皂苷。附图说明图1为人参总提物经分离、水解、定量分析色谱图；其中，标记1为共流出的中性人参皂苷；A为待测组分；B为分离组分；C为水解产物；M－D为丙二酰基人参皂苷；D丙二酰基人参皂苷水解产生的中性人参皂苷；R为中性人参皂苷D的对照品。图2为丙二酰基人参皂苷Rf分离鉴定色谱图，图2A表示人参总提取物的色谱图(检测波长：210nm)；图2B表示从总提物中在线富集的含有丙二酰基人参皂苷Rf的组分总离子流色谱图；图2C表示将化合物1水解后，所得产物的总离子流色谱图，1、2、3分别为丙二酰基人参皂苷Rf、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rf。图3为丙二酰基人参皂苷Rf的质谱图(缩写为MS)，分别是：ESI-MS(上)，CIDMS/MS(中)以及脱羧基子离子的CIDMS/MS图(下)。图4为实施例一记载的8年生人参中丙二酰基人参皂苷Rf的含量测定步骤示意图，其中I为待测样品色谱图(检测波长：210nm)、II为富集在固相萃取小柱上的样品在与I相同分离条件下获得的总离子流色谱图、III为柱上水解后的总离子流色谱图(色谱条件不同)；图中标本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种丙二酰基人参皂苷的含量测定方法，其特征在于，1)取含丙二酰基人参皂苷的组分B，将其水解获得水解产物C，包括由丙二酰基人参皂苷水解产生的中性人参皂苷；2)测定步骤1)中所得中性人参皂苷的含量D；3)根据D计算组分B中丙二酰基人参皂苷的含量。

【技术特征摘要】
1.一种丙二酰基人参皂苷的含量测定方法，其特征在于，
1)取含丙二酰基人参皂苷的组分B，将其水解获得水解产物C，包括
由丙二酰基人参皂苷水解产生的中性人参皂苷；
2)测定步骤1)中所得中性人参皂苷的含量D；
3)根据D计算组分B中丙二酰基人参皂苷的含量。
2.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，步骤1)中，
所述水解方法为碱溶液水解法。
3.根据权利要求2所述的含量测定方法，其特征在于，步骤1)中，
水解的具体步骤为，先在线将组分B其富集于固相萃取小柱，然后向固相
萃取小柱中通入碱溶液而进行水解。
4.根据权利要求3所述的含量测定方法，其特征在于，步骤1)中，
所述的富集方法为，采用阀切换法在线将丙二酰基人参皂苷吸附于固相萃
取小柱上；优选的，阀切换法的具体操作为，使丙二酰基人参皂苷组分B
的洗脱组分通过固相萃取富集柱，同时通过泵添加调节剂改变流出组分的
溶剂组成，使含丙二酰基人参皂苷组分...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖盛元，符洋洋，
申请(专利权)人：北京理工大学，
类型：发明
国别省市：北京;11