肠道病毒荧光PCR检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种采用荧光PCR技术特异性检测样品中肠道病毒核酸存在的试剂盒。利用本发明专利技术的试剂盒，可快速检测样品中是否存在肠道病毒核酸，该试剂盒能够灵敏地检测并鉴别样品中存在的肠道病毒，其检测下限为10拷贝每反应体系，在疾病监测、临床诊断等领域具有重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种采用荧光PCR技术特异性检测样品中肠道病毒核酸存在的试剂盒，属于肠道病毒的体外诊断领域。
技术介绍
肠道病毒属于单链正股RNA病毒，病毒体呈球型，衣壳为20面体对称结构，无包膜，具有感染性。在宿主细胞浆内增殖，迅速引起细胞病变。主要经粪一口途径传播，临床表现多样化，引起人类多种疾病，如脊髓灰质炎、手足口病、麻痹、无菌性脑炎、心肌损伤、腹泻和皮疹等。人肠道病毒至少由72个血清型组成，其种类有：①人脊髓灰质炎病毒1～3型；②人柯萨奇病毒A组1～22型和24型（A-23型为埃可病毒9型），B组1～6型；③埃可病毒1～9，11～27，29～34共32个血清型；④新型肠道病毒68～72型，其中1971年分出的70型，能引起急性出血性结膜炎备受重视，72型为甲型肝炎病毒。轮状病毒、肠道腺病毒。在实验室检测中，PCR法由于其快速简便的特点逐渐呈现出要替代以细胞培养和血清学检测为主的传统检测方法的趋势。而对于PCR方法来说，引物的特异性是其检测的特异性和敏感性的基础。本专利技术针对肠道病毒特异的靶序列设计引物和Taqman探针，利用real-timeRT-PCR的方法，用来鉴别检测样品中肠道病毒核酸，可以快速获得特异性检测结果。
技术实现思路
本专利技术主要解决的技术问题是快速准确地检测样品中是否存在肠道病毒，提供一种特异性检测肠道病毒的荧光PCR试剂盒。本专利技术所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：一种特异性检测样品中肠道病毒的试剂盒，组分包括PCR反应液、酶混合液、阴性质控品和阳性质控品。其中PCR反应液主要含有相关的引物和探针、反应缓冲液、Mg2+和dNTP等，酶混合液主要含有逆转录酶和热启动Taq酶，阴性质控品为无RNase和DNase水，阳性质控品为含有肠道病毒检测靶序列的RNA。PCR反应液中用于核酸扩增的引物为P1和P2，P1和P2为针对肠道病毒基因组群特异性保守序列设计并经预实验筛选出的特异性引物；PCR反应液中用于荧光信号监测的寡核苷酸探针为Probe1、2、3，为针对肠道病毒基因组群特异性保守序列设计并经预实验筛选出的特异性探针，其中荧光报告基团X1为FAM，荧光淬灭基团Y1为Eclipse（见表1）。表1检测肠道病毒的引物和探针序列名称序列P15`-CCCTGAATGCGGCTAATC-3`P25`-ATTGTCACCATAAGCAGCCA-3`Probe15`-X1-CCGACTACTTTGGGWGTCCGTGT-Y1-3`Probe25`-X1-AACTGCGGAGCACACGCCCAC-Y1-3`Probe35`-X1-TAACTGCGGAGCRCGCACCCTC-Y1-3`本专利技术的另一个目的是提供本荧光PCR检测试剂盒在检测肠道病毒的应用方法，包括：试剂盒选用的PCR反应体系为20μl，包括2×PCR缓冲液10μl、10mmol/LdNTP1.0μl、25μmol/L引物各0.5μl、10μmol/L探针0.2μl、逆转录酶和热启动Taq酶混合液0.8μl、样品RNA2μl，加灭菌水至终体系20μl。试剂盒的PCR反应循环参数为逆转录阶段：42℃，10min；预变性阶段：94℃，10sec；预扩增阶段：变性94℃，5sec；退火50℃，20sec；延伸72℃，20sec；共5个循环。注意本阶段不采集荧光信号。检测阶段：变性94℃，5sec；退火56℃，50sec；延伸72℃，15sec；共40个循环。在退火步骤检测荧光信号。质量控制：每次实验应设立阴、阳性对照，阴性对照无Ct值（或Ct值为0），阳性对照Ct值≤30，否则实验结果不成立。结果判读：阳性：出现“S”型扩增曲线，Ct值≤35；可疑：出现“S”型扩增曲线，但Ct值＞35；阴性：没有出现“S”型扩增曲线，或者曲线虽然超过了阈值，但不呈“S”型；对可疑结果，应重复实验，如果重复实验还是出现“S”型扩增曲线，阴性对照没有污染，可判断为阳性。样本要求：临床样本类型包括粪便标本、疱疹液、咽拭子和病毒培养物；临床样本采集后应带冰运输，-20℃保存，不能反复冻融；从临床样本提取RNA，建议采用性能稳定可靠的商品化试剂盒，具体方法参见相应商品化试剂盒说明书，提取的RNA应立即检测，否则，应将RNA分装后-80℃～-20℃保存。本专利技术提供的试剂盒具有很好的特异性，可以检出肠道病毒的核酸，但不能检出非肠道病毒病原体的核酸；对肠道病毒核酸的检测下限为10拷贝每反应体系；只需要2小时即可完成检测，可为肠道病毒的疾病监测和临床诊断提供实验依据。附图说明图1为单重实时荧光PCR检测肠道病毒核酸灵敏度的扩增曲线图。从左至右的5条曲线分别为肠道病毒体外转录RNA梯度稀释后（2×106-2×102copies/μl）扩增结果。横坐标为反应循环数，纵坐标为不同循环数荧光检测信号的DRn值。图2为单重实时荧光PCR检测体系对肠道病毒核酸检测特异性扩增曲线图。肠道病毒出现S型扩增曲线，而其他病原微生物质控毒株均未出现S型扩增曲线。横坐标为反应循环数，纵坐标为不同循环数荧光检测信号的DRn值。具体实施方式下面结合具体实施例详细说明本专利技术的优选实施方式。需要指出的是，这里列出的实施例仅仅为示例性说明的目的，而不应将其解释为对本专利技术范围的任何限制。其中使用的试剂盒、缓冲液等试剂仅仅为该具体实施例中具体选择的试剂，应理解，本领域技术人员可根据需要选择其他公司的相应试剂以实现本专利技术的目的。引物和TaqMan探针的设计与合成利用Blast工具对Genbank和国内外文献中所有的肠道病毒基因组序列进行分析，分别选择其稳定的保守区域作为检测靶序列，肠道病毒检测靶序列为5’UTR；并针对这检测靶序列设计和合成引物和探针（见表1）。引物和探针均由日本TaKaRa大连宝生物公司合成，其中肠道病毒的检测探针5’端标记FAM荧光基团，3’端标记Eclipse荧光淬灭基团。检测菌种的准备本实施例中所使用的肠道病毒以及其他阴性对照毒株（腺病毒3型、7型，流感病毒AH1N1、AH3N2、AH7N9，麻疹病毒，风疹病毒，副流感病毒3型，鼻病毒）均购买于中国药品生物制品检定所。菌株RNA的抽提选用德国QIAGEN公司生产的核酸提取或纯化试剂QIAampDSPVirusSpinKit(国械备20140008QIAGENGmbH)提取毒株RNA。具体步骤参考试剂盒操作说明书。引物和探针的筛选采用设计的引物和探针分别检测提取的肠道病毒和阴性对照毒株的基因组RNA，经反复实验，筛选出灵敏度、特异性和重复性最佳的引物探针组合（见序列表，肠道病毒正向引物P1、反向引物P2和探针Probe1、2、3）。标准品的构建与制备分别利用P1、P2引物，RT-PCR扩增肠道病毒特异性基因片段，并克隆至含有T7启动子序列的质粒（如pGEM-Teasyvector），使用大连宝生物公司的RNAPolymerase，合成RNA，加入无RNA酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于特异性检测样品中肠道病毒的试剂盒，其中包括PCR反应液、酶混合液、阴性质控品和阳性质控品，PCR反应液中用于核酸扩增反应的引物序列如下：P1：5`‑CCCTGAATGCGGCTAATC‑3`， P2：5`‑ATTGTCACCATAAGCAGCCA‑3`，PCR反应液中用于荧光信号监测的寡核苷酸探针的序列如下：Probe1：5`‑X1‑CCGACTACTTTGGGWGTCCGTGT‑Y1‑3`，Probe2：5`‑X1‑AACTGCGGAGCACACGCCCAC‑Y1‑3`，Probe3：5`‑X1‑TAACTGCGGAGCRCGCACCCTC‑Y1‑3`，Probe荧光报告基团X1为FAM，荧光淬灭基团Y1为Eclipse。

【技术特征摘要】
1.一种用于特异性检测样品中肠道病毒的试剂盒，其中包括PCR反应液、酶混合液、阴性质控品和阳性质控品，PCR反应液中用于核酸扩增反应的引物序列如下：
P1：5`-CCCTGAATGCGGCTAATC-3`，
P2：5`-ATTGTCACCATAAGCAGCCA-3`，
PCR反应液中用于荧光信号监测的寡核苷酸探针的序列如下：
Probe1：5`-X1-CCGACTACTTTGGGWGTCCGTGT-Y1-3`，
Probe2：5`-X1-AACTGCGGAGCACACGC...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：江苏和创生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32