利用SSR指纹图谱鉴别黄魁茶树品种的方法技术

本发明专利技术提供一种利用SSR指纹图谱鉴别黄魁茶树品种的方法，涉及到茶树全基因组中特异的SSR标记(SEQ ID No:1)及引物(SEQ ID No:4和5)。利用四份省级茶树优良品种作为样本材料，在茶树全基因组中选取415对SSR引物进行多态性筛选，最终确定1对引物作为黄魁品种鉴定的核心SSR引物，可有效将黄魁和其它三个省级茶树品种区分开，不仅有利于黄魁品种的保护及推广，还对市售黄魁茶的真伪鉴别提供了一个快速、准确的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种利用SSR指纹图谱鉴别黄魁茶树品种的方法。
技术介绍
黄化茶是由老茶树或老茶树上的部分茶枝受到外界环境因素的影响发生自然变异由原来的绿色变为黄色。这一黄化过程的机理比较复杂，外界环境不同，其黄化程度也不同。黄魁属于黄化茶之一，其特点是干茶嫩黄荷香、茶汤杏黄醇厚、叶底金黄富贵，茶氨酸和叶黄素含量高。黄魁茶树原种来源于安徽省郎溪县毕桥镇地方茶树群体中的自然变异单株，通过单株选育出具有优良性状的茶树黄化新品种——“黄魁”。“黄魁”茶树树姿呈半开状，芽叶呈金黄色，茸毛较少，发芽率高，每年的亩产量约120斤，黄魁品种适应性强，适合生长在地山丘陵地带。近几年随着我国黄化茶新品种不断增多，市场上不同品种的黄化茶仅凭肉眼从外观形态上很难区分，随着国家对植物新品种保护制度的不断完善，急需开发有效的技术措施对黄魁新品种进行精准鉴定。本专利技术利用SSR指纹图谱技术对黄魁茶树品种进行鉴定，从DNA水平上给予黄魁茶独特的指纹身份，有效防止其他品种冒充黄魁茶，从而达到保护黄魁优良品种的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用SSR指纹图谱鉴别黄魁茶树品种的方法。本专利技术利用SSR指纹图谱技术鉴别黄魁品种，其中涉及茶树基因组中一个特异的微卫星SSR标记，该标记的重复单元是由二碱基组成，其变异程度在茶树基因组中最高，特异SSR标记的核苷酸序列为：5′-CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT-3′(SEQIDNo:1)。上述SSR标记的左、右侧翼保守序列分别如SEQIDNo:2和3所示。基于SSR引物设计原则，根据上述SSR标记的侧翼序列设计引物，引物序列为：上游引物：5′-AGGCTAAAGAAGATGGAG-3′，Tm：53.8℃(SEQIDNo:4)下游引物：5′-GAGGGAATGGGTTGTCTA-3′，Tm：53.8℃(SEQIDNo:5)SSR引物的筛选步骤如下：以四份省级茶树优良品种黄魁、黄金芽、黄金茶2号和天台黄茶作为样本材料，茶树样品总DNA的提取，根据茶树全基因组序列进行SSR位点的选择和引物的设计筛选，通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳初筛，然后采用FragmentAnalyzerTM全自动毛细管电泳系统复筛，根据电泳结果筛选出核心引物。本专利技术中茶树总DNA提取是采用改良的CTAB法从干茶或茶树叶片中提取基因组DNA。对茶树全基因组序列进行SSR标记的选择和引物设计筛选，在获得10万个含SSR位点的序列中，二碱基是茶树基因组中较丰富的微卫星类型，出现最多的碱基重复单元是AT、CT，从中选取2923条含有SSR位点的序列，成功设计了415对引物，其中SSR引物筛选的原则如下：①引物的长度为18-23bp，目的片段在250bp左右。②GC含量为45％-55％，引物序列中避免出现3或4个连续碱基。③退火温度在45℃-55℃，最好在50℃左右，上、下游引物Tm值相差不大于4℃。④引物3’端避免出现A或出现3个以上连续碱基，尽量避免引物二聚体和发夹结构。所述的PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳初筛，具体是将PCR产物通过2％琼脂糖凝胶电泳，选取扩增率大于等于75％、条带单一的PCR产物进行测序，通过与目的片段比对进行引物的初筛。并通过FragmentAnalyzerTM全自动毛细管电泳系统进行复筛，能够精确地反映等位位点间的差异，筛选出多态性高的引物，最终确定一对核心引物(SEQIDNo:4和5)用于黄魁品种的鉴定。本专利技术还提供一种利用SSR指纹图谱鉴别黄魁茶树品种的方法，包括如下步骤：1)提取待测植株的基因组DNA；2)以待测植株的基因组DNA为模板，利用所述核心引物，进行PCR扩增反应；3)检测PCR扩增产物，如果能够扩增出214bp和236bp大小的特征条带，则待测植株为黄魁茶树品种。PCR扩增体系：50ng/μL基因组DNA2μL，10μM上、下游引物各0.5μL，10×EasyTaq酶缓冲液2μL，EasyTaqDNA聚合酶1U，2.5mMdNTP2μL，ddH2O加至总量20μL。PCR程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。步骤3)中采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物，然后银染显色；或者通过毛细管电泳检测PCR扩增产物。优选用FragmentAnalyzerTM全自动毛细管电泳系统检测PCR扩增产物，由于FragmentAnalyzerTM全自动毛细管电泳系统最低分辨为2bp，因此利用所述核心引物对待测植株扩增出的两条带分别是214±3bp、236±3bp，均可判定为黄魁品种。本专利技术进一步提供用于筛选或鉴别黄魁茶树品种的PCR检测试剂盒，所述检测试剂盒包含如SEQIDNo:4和5所示的核心引物。本专利技术具有以下优点：(一)本专利技术基于茶树基因组开发出SSR引物，与EST-SSR相比，具有多态性高、数量多的特点。通过大量的引物筛选，最终确定一对核心引物用于对黄魁品种的鉴定。(二)本专利技术采用SSR指纹图谱技术，该技术具有稳定性好、操作简单，准确率高的特点，对黄魁优良品种鉴定提供一种精确、快速、简单的方法。(三)本专利技术所选用的材料不受季节、环境和测试时间的限制，可以对黄魁品种生长任何时期内的任意器官，或制作好储存一段时间的干茶进行DNA提取，均不会影响鉴定结果。(四)本专利技术进行引物筛选优选用FragmentAnalyzerTM全自动毛细管电泳系统，该系统具有高通量、安全方便、灵敏度高等特点，对构建一套快速、精确的SSR指纹图谱技术起到重要作用，并缩短了黄魁优良品种鉴定的周期。附图说明图1为本专利技术实施例1中干茶或鲜叶总DNA提取的琼脂糖凝胶电泳检测结果。图2为本专利技术实施例3中利用核心SSR引物对四个茶树品种进行PCR检测的琼脂糖凝胶电泳结果。图3为本专利技术实施例3中四个茶树品种的SSR指纹图谱。图4为本专利技术实施例3中核心SSR引物的PCR产物测序结果与目的片段比对图，旨在验证引物的真实性，即扩增产物序列中是否包含SSR位点。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条本文档来自技高网...

【技术保护点】
茶树基因组中特异的SSR标记，其特征在于，所述特异的SSR标记的核苷酸序列为：5′‑CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT‑3′。

【技术特征摘要】
1.茶树基因组中特异的SSR标记，其特征在于，所述特异的SSR
标记的核苷酸序列为：
5′-CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT-3′。
2.根据权利要求1所述SSR标记的侧翼序列设计的引物，其特征
在于，引物序列为：
上游引物：5′-AGGCTAAAGAAGATGGAG-3′
下游引物：5′-GAGGGAATGGGTTGTCTA-3′
其中，所述SSR标记的左、右侧翼序列分别如SEQIDNo:2和3所
示。
3.利用SSR指纹图谱鉴别黄魁茶树品种的方法，其特征在于，
包括如下步骤：
1)提取待测植株的基因组DNA；
2)以待测植株的基因组DNA为模板，利用权利要求2所述引物，
进行PCR扩增反应；
3)检测PCR扩增产物，如果能够扩增出214bp和236bp大小的特
征条带，则待测植株为黄魁茶树品种。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦朝领，刘洪伟，饶佳，吴艾琳，何雅贤，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34