以miR-196a前体为模板制备RNA探针的方法技术

本发明专利技术涉及一种以miR-196a前体为模板制备RNA探针的方法。该方法包括：针对miR-196a前体序列设计至少一对引物，所述引物的PCR扩增产物为多重DNA片段，所述多重DNA片段能包括所有靶序列；从miR-196a前体cDNA质粒中，采用步骤A的所述引物，通过PCR扩增得到所述多重DNA片段，纯化后混合，作为模板；加入RNA聚合酶和带有生物素标记的UTP进行反应，将UTP掺入产物，纯化后得到RNA探针。本发明专利技术得到的cRNA探针能够全部覆盖所有靶序列。本发明专利技术探针制备方法简化了探针制备步骤，大幅度缩短整个实验时间，探针特异性和稳定性更强，背景信号更低且灵敏度更高。在此基础上，本发明专利技术提供了一种快速检测胰腺癌相关的miR-196a表达的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于核酸诊断领域，具体涉及一种以miR-196a前体为模板制备RNA探针的方法及其应用。
技术介绍
荧光原位杂交技术(Fluorescenceinsituhybridization，FISH)是一种重要的非放射性原位杂交技术，荧光染料标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA或RNA分子杂交，如果被检测的染色体靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而探针可以直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。通过在荧光显微镜下观察荧光信号，以确定与特异探针杂交后结合了荧光探针的DNA区域或RNA分子在染色体或其他细胞器中的定位，对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。荧光原位杂交技术(FISH)具有很多优点，无需放射性同位素标记，安全性较高；FISH的实验周期短，探针稳定性强；通过多次免疫化学反应，使其杂交信号放大，提高灵敏度，检测的灵敏度接近同位素探针杂交；FISH的分辨率高达3-20Mb；FISH可以用不同修饰核苷酸分子标记不同的探针，即可以制备成多色探针。FISH技术已经在基因定位、基因作图、基因扩增和缺失的检测、产前诊断、哺乳动物染色体进化研究等领域得到了广泛应用，特别是在肿瘤诊断方面，FISH技术被广泛用于乳腺癌、膀胱癌、肺癌、淋巴瘤等实体瘤的早期诊断、疗效检测、个体化治疗和预后判断等几个方面。cRNA探针比cDNA探针有更多的优势：避免了双链cDNA探针在杂交反应中两条链之间易复性的可能性，提高了杂交反应的敏感性；cRNA与RNA之间形成的杂交体比cDNA-RNA杂交体更稳定；且cRNA-RNA之间形成的杂交体不受RNA酶的影响，因此杂交反应后可用RNA酶处理，以除去未结合的探针，可降低本底信号的影响。制备特异性强、灵敏度高和稳定性强的肿瘤检测探针，生产易保存和运输相关试剂及试剂盒，对肿瘤早期诊断和治疗至关重要。研发出用于诊断和治疗多种肿瘤的高品质探针及相关试剂盒，不仅能提高人民的健康水平，而且具有很大的经济效益、社会效益及广阔的市场前景。microRNA(简称miRNA)是内源性非编码RNA，为长约18～25核苷酸的单链RNA，呈高度保守性、时序表达特异性以及组织表达特异。miRNA对其靶基因的转录后表达调节非常重要，当miRNA和靶向mRNA完全或几乎完全互补时，可使得目的mRNA的降解，当miRNA和靶向mRNA不完全互补时，则负调控翻译过程，阻碍蛋白质翻译。miRNA在实体恶性肿瘤以及血液系统肿瘤发病过程中起着重要的作用，具有肿瘤的抑癌基因与癌基因的双重作用，参与了生物体的发育、增殖、分化和凋亡等方面的调控。肿瘤细胞中，miRNA的表达谱与肿瘤的类型相关，不同种类肿瘤发生具有自己独特的miRNA表达谱，提示miRNA可作为肿瘤鉴别诊断的标志物。miRNA可在肿瘤发生过程中调节细胞增殖或凋亡，Bloomston等(BloomstonM,FrankelWL,PetroccaFetal,MircorRNAexpressionpatternstodifferentiatepancraticadenocarcinomafromnormalpancreasandchronicpancreatitis[J],JAMA,2007,297(17):1901-1908)应用miRNA芯片技术检测326个miRNAs的表达，研究表明在90％的胰腺癌中21个miRNAs上调和4个miRNAs下调。有研究表明，miR-196a很可能在胰腺癌细胞中特异表达，与胰腺癌的生物学特性存在密切关系，同时能积极反映胰腺癌的进展，并且是一个重要的预后诊断标志物(LiuM，DuY，GaoJ，etal.Aberrantexpressionmir-196aisassociatedwithabnormalapoptosisinvasion，andproliferationofpancreaticcancercells[J]Pancreas,2013,42(7):1169-1181.)。胰腺癌是恶性程度比较高的消化系统疾病，死亡率在全球范围内占第5位，发病率在中国也呈逐年上升趋势，其起病隐匿、早期发现困难，一旦发现多属晚期，多数无法手术。然而，手术切除是胰腺癌治疗的唯一根治疗法，但因其早期即可发生浸润和转移，导致胰腺癌手术切除率低。胰腺癌肿瘤标记物包括许多方面，如血清类肿瘤标记物、癌胚肿瘤标志物、基因类肿瘤标志物和其他几十种胰腺癌相关基因及它们表达的蛋白质、生长因子、黏附分子等。但上述标记物检测时均有不足之处，故需寻找更多的生物标记和更好的检测诊断方法，近年来，miRNA在胰腺癌诊断中的运用是人们关注的热点。胰腺癌的早期诊断和治疗能提高胰腺癌患者的生存率。因此，制备胰腺癌miRNARNA早期诊断探针至关重要，并为胰腺癌治疗提供一个崭新的思路(KongX,DuY,WangG,etal.DetectionofdifferentiallyexpressedmicroRNAsinserumofpancreaticductaladenocarcinomapatients:miR-196acouldbeapotentialmarkerforpoorprognosis[J].DigDisSci,2011,56(2):602-09.)。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用miR-196a前体为模板制备RNA探针的方法。本专利技术所述的以miR-196a前体为模板制备RNA探针的方法包括以下步骤：A.针对miR-196a前体序列设计至少一对引物，所述引物的PCR扩增产物为多重DNA片段，所述多重DNA片段能包括所有靶序列；B.从miR-196a前体cDNA质粒中，采用步骤A的所述引物，通过PCR扩增得到所述多重DNA片段，纯化后混合，作为模板；C.加入RNA聚合酶和带有生物素标记的UTP进行反应，将UTP掺入产物，纯化后得到RNA探针。根据本专利技术所述的以miR-196a前体为模板制备RNA探针的方法的进一步特征，所述RNA聚合酶是T7RNA聚合酶，引物的5'端加上T7启动子序列。根据本专利技术所述的以miR-196a前体为模板制备RNA探针的方法的进一步特征，所述RNA聚合酶是SP6RNA聚合酶，引物的5'端分别加上SP6启动子序列。根据本专利技术所述的以miR-196a前体为模板制备RNA探针的方法的进一步特征，所述RNA聚合酶是T3RNA聚合酶，引物的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以miR‑196a前体为模板制备RNA探针的方法，其特征在于，包括以下步骤：A.针对miR‑196a前体序列设计至少一对引物，所述引物的PCR扩增产物为多重DNA片段，所述多重DNA片段能包括所有靶序列；B.从miR‑196a前体cDNA质粒中，采用步骤A的所述引物，通过PCR扩增得到所述多重DNA片段，纯化后混合，作为模板；C.加入RNA聚合酶和带有生物素标记的UTP进行反应，将UTP掺入产物，纯化后得到RNA探针。

【技术特征摘要】
1.一种以miR-196a前体为模板制备RNA探针的方法，其特征在于，包括
以下步骤：
A.针对miR-196a前体序列设计至少一对引物，所述引物的PCR扩增产物
为多重DNA片段，所述多重DNA片段能包括所有靶序列；
B.从miR-196a前体cDNA质粒中，采用步骤A的所述引物，通过PCR扩
增得到所述多重DNA片段，纯化后混合，作为模板；
C.加入RNA聚合酶和带有生物素标记的UTP进行反应，将UTP掺入产物，
纯化后得到RNA探针。
2.根据权利要求1所述的以miR-196a前体为模板制备RNA探针的方法，
其特征在于，所述RNA聚合酶是T7RNA聚合酶，引物的5'端加上T7启动子
序列。
3.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐学明，鲁隼，冯俊清，
申请(专利权)人：广州复能基因有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44