一种基于仿生学的组织工程骨的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种基于仿生学的组织工程骨的制备方法，包括以下步骤：根据“仿生学”及“自主装”原理，首创性地采用“二次脱矿技术”制备出与天然骨结构和功能基本类似的异体骨来源的生物衍生支架材料作为支架，选用具有自发成骨现象的骨髓间充质干细胞(BMMSCs)作为种子细胞，采用低氧环境来模拟体内BMMSCs的生长微环境作为诱导因子，来制备出具有与天然骨组成、微结构及生物反应性相似的组织工程骨。该法制备出的组织工程块状骨，具有明显的成骨诱导性和血管化作用，可用于颌面部或骨科出现较大骨缺损的功能性骨重建修复。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医用材料领域，尤其涉及为一种如何基于“仿生学”及“自主装原理”制备组织工程骨的新方法。
技术介绍
骨缺损的功能性修复重建一直是当前的重要研究课题。骨组织工程作为骨重建/替代治疗的一种有效手段，其研究的关键因素包括种子细胞、支架材料和诱导调节因子等三个方面。目前骨替代材料可大体分为三类：自体骨、以无机材料或/和有机材料合成的人工替代材料以及由异体骨加工而来的衍生骨支架材料。自体骨由于无免疫原性且具有良好的骨诱导性、骨引导性及完美的力学匹配性而成为骨缺损修复最佳的选择。但是由于自体骨来源有限、取材量小且容易造成供体部位的功能障碍以及由此引发的并发症和不良后果影响着它们在临床上的大量运用。而人工合成的支架材料存在较差的生物相容性、生物活性、生物降解性及与宿主骨的力学匹配性等问题。另外，孔隙率和孔隙大小等方面也难以模仿天然骨的特性；而且有些材料的酸性降解产物还影响到细胞的附着、增殖和分化。因此，异体来源的衍生骨支架材料，为我们提供了希望和解决问题的思路。由于这些支架材料来源广阔、拥有天然骨相似的结构、力学性能和生物学功能，并且它们可加工成各种大小和形状的骨块可以满足临床手术中对支架多样化的需求。在种子细胞选择上，BMMSCs具有取材方便、细胞量大、易于增殖分化及较好的免疫耐受性等特点。作为具有多向分化潜能的干细胞，BMMSCs是组织工程骨理想的种子细胞。由于在体外无成骨诱导液的情况下，BMMSCs即可发生自发成骨矿化现象。大量的体内研究也证实异位注入BMMSCs可在心肌、血管及软骨内发生矿化现象并形成可见的钙结节。在选择诱导调节因子上，不仅要考虑诱导因子具有促进支架材料上细胞的成骨反应，还要考虑该因子具有促进支架材料的血管化反应或促进血管化相关因子的表达。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有“组织工程骨制备”存在的不足之处，提供一种基于“仿生原理”的新型组织工程骨制备。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种基于仿生学的组织工程骨的制备方法，包括以下步骤：(1)将P3-5代BMMSCs在多孔的生物支架材料上孵育3h；其中孵育过程中，使用的培养基为全培养基，孵育条件为37℃、含5％CO2、饱和湿度；(2)转移至密闭的水套式CO2细胞培养箱，每天换液，培养21天后获得功能性组织工程骨；培养过程中，使用的培养基为全培养基，培养条件为于37℃、饱和湿度、5％CO2、5％O2、95％N2。进一步地，所述生物支架材料通过以下步骤制备得到：(1.1)将带有皮质骨的骨块，用去离子水清洗后，用38℃的30vol％过氧化氢浸泡脱脂24h；(1.2)去离子水冲洗后，用4℃的0.6M盐酸浸泡脱钙4h；(1.3)去离子水冲洗后，于乙醇中浸泡4h以去除剩余的过氧化氢；(1.4)在室温下用氯仿/甲醇的混合溶液(体积比1:1)浸泡处理1h；(1.5)用4℃的0.25vol％胰蛋白酶(一般溶剂为PBS)浸泡处理12h，再用20～30℃的0.5vol％SDS(一般溶剂为PBS)浸泡处理4h，以脱蛋白；(1.6)用4℃的0.6M盐酸第二次浸泡脱钙1h。(1.7)去离子水冲洗后，在-38℃，10-5Pa下冷冻干燥24h；(1.8)利用60Coγ-ray放射线照射，去除支架材料的抗原性。进一步地，所述生物支架材料在孵育前，还用无菌的PBS浸泡24h，然后用无FBS的L-DMEM浸泡2d，再用无菌的棉球或纱布吸除残留的L-DMEM。本专利技术的有益效果在于：(1)本专利技术通过一系列复杂的“脱脂”、“脱蛋白”、并首创性地采用“二次脱矿法”制备出无“免疫原性”、但却保留良好“骨诱导性”并具有良好“生物相容性”的生物衍生骨支架材料。(2)BMMSCs具有取材方便、细胞量大、易于增殖分化及较好的免疫耐受性等特点。由于在体外无成骨诱导液的情况下，BMMSCs可发生自发成骨矿化现象。因此还可免除调配并加入成骨诱导液等繁复程序。(3)相对于需购买FGF1/2、GDF5、GH、TGFβ、PDGF等细胞因子作为诱导剂，低氧作为一种诱导因子，具有容易获取、简单、经济等优势。另外，低氧可模拟BMMSCs生活的体内微环境，不仅可以促进成骨矿化反应还可以促进支架材料的血管化进程。(4)制备得到的组织工程骨具有较高的成骨能力，且含有丰富的血管化因子(VEGF、Runx2、BMP2、BMP4、OPN)。附图说明图1是本专利技术所制得异体骨来源的生物衍生骨支架材料的实体图(图1A)、扫描电镜图(图1B)、成骨诱导性分析(图1C-D)、及生物相容性分析(图1E)；图2是种子细胞BMMSCs在支架材料上及低氧环境下的细胞优势增殖；图3是是种子细胞BMMSCs在支架材料上及低氧环境下的成骨矿化及血管化反应(图3A-VEGF、图3B-Runx2、图3C-BMP2、图3D-BMP4、图3E-OPN)；图4是经种子细胞复合后并在低氧环境下培养21d后的支架材料修复实验动物胫骨骨缺损(图4A-3周、图4B-6周、图4C-12、图4D-未处理组)的愈合进程。具体实施方式目前对异体骨的加工通常采用脱脂肪、脱蛋白、脱矿等物理和化学手段。适当的脱矿处理可以从钙化的骨基质中释放出一些有利于细胞成骨分化的诱导因子。而脱脂脱蛋白处理主要是去除骨组织中一些异体来源的免疫反应原从而降低移植后宿主的排斥反应。但是过分的脱脂脱蛋白处理会使细胞外基质中一些有利于细胞成骨分化和细胞外基质矿化的小分子物质同时被洗脱掉。因此脱矿和脱脂/脱蛋白处理之间的平衡是保留生物衍生骨支架材料的骨诱导性同时去除免疫原性的关键。众多研究表明将异体骨浸泡在盐酸中15min即可使骨组织开始脱矿，24h后可使骨组织完全脱矿。据此我们采取了将骨组织脱矿5h的折中措施。同时，分两步进行：第一步脱矿4h主要是让异体骨内的免疫原充分暴露以利于后续的脱蛋白处理；第二步继续脱矿1h主要是让钙化的骨基质中一些有利于细胞成骨分化的诱导因子充分释放。这种两步法的脱矿处理方式可从根本上解决生物衍生骨支架材料制作过程中存在的矛盾。本专利技术通过“二次脱矿技术”的方法，制备出与天然骨结构和功能基本类似的异体骨来源的生物衍生支架材料，并通过复合具有自发成骨效应的BMMSCs,在低氧培养环境下制备富有成骨及血管化因子(VEGF、Runx2、BMP2、BMP4、OPN)的功能性组织工程骨。采用这种组织工程骨来修复动物大块骨缺损，并取得较明显的骨重建效果。具体步骤如下：(1)将带有皮质骨的骨块，去离子水清洗干净，于38本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于仿生学的组织工程骨的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将P3‑5代BMMSCs在多孔的生物支架材料上孵育3h；其中孵育过程中，使用的培养基为全培养基，孵育条件为37℃、含5％CO2、饱和湿度；(2)转移至密闭的水套式CO2细胞培养箱，每天换液，培养21天后获得功能性组织工程骨；培养过程中，使用的培养基为全培养基，培养条件为于37℃、饱和湿度、5％CO2、5％O2、95％N2。

【技术特征摘要】
1.一种基于仿生学的组织工程骨的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将P3-5代BMMSCs在多孔的生物支架材料上孵育3h；其中孵育过程中，使用的培养基
为全培养基，孵育条件为37℃、含5％CO2、饱和湿度；
(2)转移至密闭的水套式CO2细胞培养箱，每天换液，培养21天后获得功能性组织工程
骨；培养过程中，使用的培养基为全培养基，培养条件为于37℃、饱和湿度、5％CO2、5％O2、
95％N2。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物支架材料通过以下步骤制备得
到：
(1.1)将带有皮质骨的骨块，用去离子水清洗后，用38℃的30vol％过氧化氢浸泡脱脂
24h；
(1.2)去离子水冲洗后，用4℃的0.6M盐酸浸泡脱钙4h；
(1...

【专利技术属性】
技术研发人员：周益，沈建伟，关晓旭，王慧明，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33