一种CMV‑PVY双重病毒胶体金快速检测试纸条制造技术

本发明专利技术公开了一种CMV‑PVY双重病毒胶体金快速检测试纸条，由样品垫、胶体金垫、NC膜、吸水滤纸和背衬组成；所述胶体金垫上包被有胶体金标记的CMV特异抗体和PVY特异抗体，两种抗体分别由杂交瘤细胞株BALBc‑15‑27、BALBc‑15‑8分泌产生；所述NC膜上设置有检测线和控制线，检测线上包被有两种病毒的特异抗原；控制线上包被有胶体金标记的二抗。该试纸条尤其是对广东烟区的CMV、PVY的检测，快速、灵敏、准确、成本低、操作简便，实现一次取样，两种病毒同时诊断，非常适合对大批量样品进行现场初筛，在实际生产中很有应用价值，推广应用前景好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于病原物检测
更具体地，涉及一种CMV-PVY双重病毒胶体金快速检测试纸条。
技术介绍
黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)、马铃薯Y病毒(PotatovirusY，PVY)是侵染烟草的主要病毒。它们引发的病毒病每年导致烟草产业巨大的经济损失。快速、准确地定性检测相关病毒是生产上防控病害、减少损失的重要手段之一。在科学研究中，植物病毒的检测方法主要有生物学检测法(症状类型辨别、鉴别寄主等)、电镜技术、血清学检测法(酶联免疫吸附反应(Enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)等)和分子生物学检测法(包括PCR技术、核酸探针技术等)等。分离病毒照电镜虽然是诊断病毒的有效手段，其特异性强，但非常费时费力，需要专业的技术人员，不适合推广使用。血清学检测方法比较费时、费力。免疫荧光、ELLSA等方法虽然具有微量、特异、快速、准确的优点，但需要比较完备的试验仪器和经验丰富的技术人员来操作和判断结果，检测一批样品整个流程需要4～8小时，对于基层工作场所很难做到。PCR及核酸探针的诊断更需要有特殊的仪器和药品，技术含量很高，一般只适于实验室诊断或研究应用，很难在基层推广。因此，迫切需要建立一种简单、快速、灵敏、廉价并且适合于基层应用的病毒诊断方法。1971年胶体金作为标记物开始用于免疫组织化学。Faulk等应用电镜免疫胶体金染色法观察沙门氏菌。许多学者进一步证实胶体金能稳定迅速地吸附蛋白质，而蛋白质的生物活性无明显改变。它可以作为探针进行细胞表面和细胞内多糖、蛋白质、多肽、抗原、激素、核酸等生物大分子的精确定位，也可以用于日常的免疫诊断，进行免疫组织化学定位。胶体金溶液是指分散相粒子直径在1～150nm之间的金溶胶，属于多相不均匀体系，颜色呈桔红色到紫红色。免疫胶体金层析技术(Goldimmunochromatographyassay，GICA)作为一种新的免疫学检测方法，是20世纪80年代在免疫胶体金标记技术基础上建立起来的一种新型独特的诊断技术。这项技术将胶体金标记技术、免疫检测技术、层析分析技术、单(多)克隆抗体技术和新材料技术等多种方法有机结合在一起，具有简单、快速、准确、无污染、操作简单和无需特殊设备等优点，在医学、动植物检疫、食品安全监督各领域得到了日益广泛的应用。20世纪90年代初到中期，胶体金标记免疫层析诊断技术开始进入商业化应用。利用这种技术开发的胶体金快速检测试纸条具有操作简便、快捷、可单份检测、便于保存、不需特殊设备等优点，可在现场(临床)对目标病原进行初筛，节省大量的人力、物力。在医学领域，这种技术除用于激素、传染病病原的抗原和抗体、细菌、寄生虫的检测外，还发展到了对毒品等小分子物质的检测。检测的标本类型也涵盖了血清、血浆、全血、尿、粪便及唾液等，显示出了广阔的前景和巨大的应用价值。目前，胶体金试纸条在国内主要应用于医学领域和畜牧兽医领域，植物病毒方面很少见到。在农牧领域，较少有成熟的产品，更多的出现在相关的科研项目中。孙艳等(2011)应用胶体金技术进行了黄瓜细菌性角斑病(Pseudomona.s.syringaepv.Lachrymans)的快速检测研究。国内涉及到烟草病毒病检测的商用胶体金试纸条非常少。国外的商品化试纸条非常昂贵，价格在50～60元人民币/张，不适于生产上大批烟苗的检测使用。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种广东烟区CMV-PVY双重病毒胶体金快速检测试纸条。核心技术是开发针对烟草苗期主要病毒黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)、马铃薯Y病毒(PotatovirusY，PVY)的双重胶体金检测试纸条。实现一次取样，两种病毒同时诊断，让烟农操作方便，诊断及时准确。本专利技术的目的是提供一株可以产生CMV特异单抗的杂交瘤细胞株BALBc-15-27，以及一株可以产生PVY特异单抗的杂交瘤细胞株BALBc-15-8。本专利技术另一目的是提供一种CMV-PVY双重病毒胶体金快速检测试纸条。本专利技术的再一目的是提供所述CMV-PVY双重病毒胶体金快速检测试纸条的应用。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：一株产生CMV的特异单抗的杂交瘤细胞株BALBc-15-27，于2016年6月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.12679，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。同时，由上述杂交瘤细胞株BALBc-15-27分泌产生的CMV特异抗体也在本专利技术的保护范围之内。一株产生PVY的特异单抗的杂交瘤细胞株BALBc-15-8，于2016年6月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.12677，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。同时，由上述杂交瘤细胞株BALBc-15-8分泌产生的PVY特异抗体也在本专利技术的保护范围之内。另外，由上述CMV特异抗体和PVY特异抗体制备的CMV-PVY双重病毒胶体金快速检测试纸条，也在本专利技术的保护范围之内。优选地，所述CMV-PVY双重病毒胶体金快速检测试纸条由样品垫、胶体金垫、NC膜、吸水滤纸和背衬组成；所述样品垫、胶体金垫和NC膜按照从左至右、从上至下的顺序依次结合在背衬同一面上，胶体金垫和NC膜的端部重叠；所述吸水滤纸结合在NC膜的另一端；所述胶体金垫上包被有胶体金标记的CMV特异抗体和PVY特异抗体，所述NC膜上设置有检测线(T线)和控制线(C线)，且检测线(T线)位于胶体金垫和控制线(C线)之间的位置；检测线(T线)上包被有两种病毒的特异抗原；控制线(C线)上包被有胶体金标记的二抗。上述CMV-PVY双重病毒胶体金快速检测试纸条在CMV和/或PVY病毒的检测方面，具有很好的应用前景，尤其是针对广东烟区的CMV和/或PVY病毒，检测灵敏度可以达到1g/100mL。本专利技术利用竞争抑制法，成功构建了CMV-PVY的双重检测试纸条。其基本原理如下：胶体金标记的CMV、PVY特异抗体吸附在结合垫(即胶体金垫)上，两种病毒的特异抗原以条带状固定在硝酸纤维膜的测试线(T线)处上，胶体金标记的二抗固定在硝酸纤维膜的控制线(C线)处。当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记特异试剂后相互反应，再移动至固定的抗原区域时，待检物与金标记抗体的结合物又与之发生特异性结合。当待测样本含有CMV、PVY当中的一种或两种时，它与溶解在样本垫上的胶体金标记的相应病毒的特异抗体相互反应；再移动至固定的抗原区域时，已经没有足够的金标抗体与固定的抗原反应，T线处没有红棕色线条出现，实验结果为阳性。游离的金标抗体或者金标抗体复合物流经C处时，与该处的二抗结合出现红棕色质控带。当待测样本没有CMV、PVY当中的任意一种病毒时，它与溶解在结合垫上的胶体金标记抗体不发生反应；再移动至固定的抗原区域时，有足够的金标抗体与固定的抗原反应，而被截留聚集在T线上，可通过肉眼观察到红棕色条带，实验结果为阴性。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术首次针对植物病毒构建了双重病毒的检测试纸条，创新性很强，开发的CMV-PVY双重本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株产生CMV的特异单抗的杂交瘤细胞株BALBc‑15‑27，其特征在于，于2016年6月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12679，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

【技术特征摘要】
1.一株产生CMV的特异单抗的杂交瘤细胞株BALBc-15-27，其特征在于，于2016年6月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.12679，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。2.一种CMV病毒的特异抗体，其特征在于，由权利要求1杂交瘤细胞株BALBc-15-27分泌产生。3.一株产生PVY的特异单抗的杂交瘤细胞株BALBc-15-8，其特征在于，于2016年6月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.12677，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。4.一种PVY病毒的特异抗体，其特征在于，由权利要求3杂交瘤细胞株BALBc-15-8分泌产生。5.一种CMV-PVY双重病毒胶体金快速检测试纸条，其特征在于，由样品垫、胶体金垫、NC膜、吸水滤纸和背衬组成；所述样品垫、胶体金垫和NC膜按照从左至右、从上至下的顺序依...

【专利技术属性】
技术研发人员：阮小蕾，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44