一种高效利用精氨酸和瓜氨酸的解淀粉芽孢杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种高效利用精氨酸和瓜氨酸的解淀粉芽孢杆菌及其应用，属于食品微生物技术领域。本发明专利技术利用等离子诱变育种得到一株高效利用精氨酸和瓜氨酸的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JY06‑C12，该菌株能够在高盐条件下高效利用精氨酸和瓜氨酸，且具有良好的传代稳定性。将该菌株添加至酱油酿造过程中，能够使氨基甲酸乙酯的前体物瓜氨酸含量降低15.7％，有助于控制和降低酱油氨基甲酸乙酯的含量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种高效利用精氨酸和瓜氨酸的解淀粉芽孢杆菌及其应用，属于食品微生物

技术介绍
氨基甲酸乙酯(Ethylcarbamate,EC)是一种致癌物质，被人体持续过量摄入可能会引发肺癌、肝癌等严重肿瘤疾病，并且对人体的免疫系统造成伤害。酱油是食品工业广泛使用的一种发酵调味品，是具有独特色、香、味的营养丰富的功能性食品，在中国已有2500年的生产历史。近年的研究结果表明，潜在的致癌物质氨基甲酸乙酯(EC)，在酱油中尤其是日式工艺所生产的酱油中广泛存在，这严重的影响了酱油的食品安全性。酿造酱油中氨基甲酸乙酯的主要前体物质是瓜氨酸与乙醇。因此降低酱油中瓜氨酸的含量是我们降低酱油中氨基甲酸乙酯有效措施之一。在酱油生产前期，原料水解出大量精氨酸，这些精氨酸在一大类厌氧或兼性厌氧的乳酸菌的作用下，被转化为瓜氨酸。如果这些精氨酸被一些具有完整精氨酸脱亚氨基途径的菌株利用，将精氨酸转化成鸟氨酸，就能降低酱油中的瓜氨酸积累。因此，筛选一株能够耐受高盐，并且能够高效转化精氨酸且不积累瓜氨酸的菌株，对于降低酱油中氨基甲酸乙酯的含量有重要应用价值。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)JY06-C12，已于2016年9月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2016498，保藏地址为中国武汉武汉大学。本专利技术的第二个目的是提供所述解淀粉芽孢杆菌的培养方法，是将所述解淀粉芽孢杆菌BBE-JY06-C12接种至LB液体培养基，30℃静置培养24～48h。在本专利技术的一种实施方式中，所述LB培养基还含有80～150g/LNaCl。在本专利技术的一种实施方式中，所述解淀粉芽孢杆菌JY06-C12培养条件为：将保藏的诱变菌株在含100g/LNaCl的LB固体培养基上划线，于37℃静置培养2d。本专利技术的第三个目的是提供一种降低酱油中瓜氨酸含量的方法，所述方法是将所述解淀粉芽孢杆菌JY06-C12接种至酱醪中。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法是在酱油发酵的第0～3d接种解淀粉芽孢杆菌至酱醪中解淀粉芽孢杆菌达到106CFU/mL至108CFU/mL。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法，具体是：(1)制曲：脱脂大豆与炒麦经浸泡、灭菌、降温后，加入麸皮、面粉，并接种米曲霉孢子，培养，待曲变成嫩绿色，制曲完成；(2)发酵：成曲拌盐水，开始发酵，在发酵的起始至第0～3天内接种解淀粉芽孢杆菌，控温10～20℃，发酵第7d接种107CFU/mL(最终在酱醪中的浓度)的鲁氏酵母，发酵第14d再接种鲁氏酵母至107CFU/mL(最终在酱醪中的浓度)，30℃恒温发酵，第90d结束发酵。有益效果：本专利技术的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)JY06-C12能够在高盐条件下高效利用精氨酸和瓜氨酸，其对精氨酸的利用率达到了96.3％，不积累瓜氨酸，且具备良好的传代稳定性。将该菌株添加至酱油酿造过程中，能够使氨基甲酸乙酯的前体物瓜氨酸含量降低15.7％，有助于控制和降低酱油氨基甲酸乙酯的含量。附图说明图1为突变株JY06-C12的遗传稳定性；JH06，解淀粉芽孢杆菌BBE-JY06；C12，解淀粉芽孢杆菌JY06-C12；*代表传代200代后的菌株。生物材料保藏解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)JY06-C12，已于2016年9月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2016498，保藏地址为中国武汉，武汉大学。具体实施方式氨基酸检测培养基：酵母膏5g/L，牛肉膏5g/L，胰蛋白胨5g/L，NaCl180g/L，葡萄糖0.5g/L，Tween-801g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，MnSO4·H2O0.05g/L，FeSO40.4g/L，柠檬酸三胺2g/L，CaCO30.1g/L，吡哆醛-5-磷酸0.05g/L，K2HPO42g/L，pH6.0。用于检测特定氨基酸时，添加待测氨基酸6g/L。解淀粉芽孢杆菌JY06-C12培养方法：将保藏的菌株在含100g/LNaCl的LB固体培养基上划线，于37℃静置培养2d，挑取单菌落接入含100g/LNaCl的LB液体培养基，37℃摇床培养36h，8000rpm离心1min后去上清，所获得菌体的用pH7.0的磷酸盐缓冲液重悬浮。氨基酸检测方法：采用高效液相色谱法(HPLC法)进行测定。测定前对样品进行前处理：取1mL发酵液，12000rpm/min离心10min后去除菌体取上清。用5％的三氯乙酸将上清液稀释5倍后，经孔径为0.22μm的滤膜过滤，处理后的样品置于-20℃保存。色谱条件是：Agilent1200色谱仪，色谱柱C18，孔径250×4.6mm。检测器为VWD紫外检测器，检测波长338nm，柱温40℃。流动相A相(1L)：无水乙酸钠5g，四氢呋喃5mL，三乙胺200μL，pH为7.2。流动相B相(1L)：无水乙酸钠5g，超纯水200mL，甲醇400mL，乙腈400mL，pH为7.2。实施例1：解淀粉芽孢杆菌的筛选(1)以保藏编号为CCTCCNO:M2015423的解淀粉芽孢杆菌BBE-JY06(实施例中简写作解淀粉芽孢杆菌JY06)作为出发菌株，将解淀粉芽孢杆菌JY06接种至LB液体培养基，37℃，220rpm/min摇床培养4～6h至对数生长期。(2)取10μL的菌悬液滴加在灭菌冷却后的载玻片上，用ARTP进行等离子诱变，诱变时间分别为0s、5s、10s、15s、20s、40s、60s。(3)将诱变后的菌悬液转移至装有1mL生理盐水的无菌管中，然后将样品稀释至10-1～10-3三个浓度，取稀释液涂布于筛选培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养24～36h，每个处理重复三次。(4)挑取菌落进行精氨酸显色复筛。(5)移取50μL满足初筛条件的菌株所对应的上清液于1.5mL的离心管中，然后再分别向离心管中加入40g/LNaOH溶液、80g/L甲萘酚正丙醇溶液和0.5mL/L双乙酰正丙醇溶液各1mL，震荡摇匀后，放入30℃水浴锅中显色反应15min。取出冷却一段时间后，在分光光度计上测吸光值OD540，以未接种的培养基作为对照。吸光值OD540较小的菌株即为高效利用精氨酸的菌株。实施例2：解淀粉芽孢杆菌JY06-C12利用精氨酸能力分析分别挑取平板上活化好的原始菌株解淀粉芽孢杆菌JY06和突变菌株解淀粉芽孢杆菌JY06-C12的单菌落接种于100g/LNaCl的LB液体培养基中，37℃摇床培养36小时，取5mL菌液离心1min(8000rpm，4℃)弃上清，所获菌体加入1mLpH7.0的磷酸盐缓冲液重悬浮。向5mL离心管中加入4mL含10g/L的精氨酸的氨基酸检测培养基，接种500μL的悬浮菌液，接种后OD600为7.8。30℃静置培养3天后用HPLC的方法检测培养基中精氨酸和瓜氨酸以及鸟氨酸含量。表1精氨酸代谢相关氨基酸含量注：ΔArg(g/L)：精氨酸的消耗量；ΔCit(g/L)：瓜氨酸的生成量；ΔOrn(g/L)：鸟氨酸的生成量由表1可知，解淀本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JY06‑C12，已于2016年9月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2016498，保藏地址为中国武汉武汉大学。

【技术特征摘要】
1.一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)JY06-C12，已于2016年9月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2016498，保藏地址为中国武汉武汉大学。2.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，是接种至LB培养基在37℃下培养24～48h。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述LB培养基还含有80～150g/LNaCl。4.一种降低酱油中氨基甲酸乙酯含量的方法，其特征在于，所述方法是将权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌JY06-C12接种至酱醪中。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在酱油发酵的第0～3d接种解淀粉芽孢杆菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：方芳，张梦寒，王博，陈坚，堵国成，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32