枯草芽孢杆菌ZKGS01及其在防治植物真菌病害中的应用制造技术

本发明专利技术提供一株具有生防效果的枯草芽孢杆菌ZKGS01，菌株ZKGS01的保藏编号为CGMCC No.12456。本发明专利技术还提供菌株ZKGS01在防治植物真菌病害中的应用。本发明专利技术分离得到的具有良好抗植物真菌病害效果的生防菌，为制备生物杀菌剂提供宝贵资源。通过具有生防效果的枯草芽孢杆菌ZKGS01应用来替代原有的化学杀菌剂，以减少化学杀菌剂对环境和植物的不利影响，为绿色中草药材的生产奠定基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物学及生物防治
，具体地说，涉及枯草芽孢杆菌ZKGS01及其在防治植物真菌病害中的应用。
技术介绍
中草药作为我国传统医学的独特药物，是中医区别于其他医学的重要标志，也是我国优秀文化遗产之一，千百年来一直是我国预防和治疗疾病的重要手段之一。与西药相比，中草药虽然见效慢，但其副作用低。目前，世界范围内对中草药的关注度也在日益增加，致使中草药的市场需求量不断增加，中药材已发展成为中国农业的特色经济作物，在农业产业结构调整及农民增收中发挥着重要的功能。随着中药材种植面积的不断增加，其病虫害发生猖獗，给中草药产业带来巨大的经济损失。在中药材的病害中，真菌病害是一类主要的侵染性病害，其可以侵染草药的根，造成根的腐烂，如Fusariumsp.或Rhizoctoniasp.等；侵染茎，造成苗期的猝倒或植株的死亡，如Rhizoctoniasp.或Colletotrichumsp.等；侵染叶片或果实，会出现叶斑或果实腐烂等病症，如Colletotrichumsp.或Alternariasp.等。因此有效的病害防治措施是保证中药材产业健康快速发展的根本。化学防治虽然在中药材病害防治中占主导地位，但其极易导致农药残留、污染环境、使病原菌产生抗药性、甚至降低药材的品质，不符合《中药材生产质量管理规范》(GAP)的要求，不利于中药材产业的可持续发展。另外，由于药材批发商或者中药材企业在购入药材时很少对农药残留进行检测，因此富含农药残留的中草药很容易进入流通环节，这给消费者的身体健康带来了隐患。2013年，绿色和平组织抽检了同仁堂药店、云南白药大药房、云南特安呐药房、九芝堂、天士力大药房、广药集团的采芝林、山东宏济堂、胡庆余堂、张仲景大药房等9家连锁中药房的当归、三七、枸杞、金银花等常用中药材。第三方机构的检测结果显示，在65个抽检样本中有48个样品中检测到农药残留，占样本比率的74％(http://finance.sina.com.cn/blank/lshpzy.shtml)。随着人们食品安全意识的提高，越来越青睐于无残留、无毒及无污染的生物防治措施。生物防治是以生物控制有害生物种群数量的方法。而对生物防治的定义包括两种不同的理解。广义的生物防治把用以控制有害生物的“生物”理解成生物体及其产物。生物“产物”的含义非常广，例如植物的抗害性和杀生性植物、昆虫的不育性、激素及外激素、抗生素的利用，均可认为是生物防治。狭义的生物防治，也是我国目前沿用的生物防治，主要包括利用天敌控制有害生物。生物防治最大优点是绿色无污染，是农药等非生物防治病虫害方法所不能比拟的。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株具有生防效果的枯草芽孢杆菌ZKGS01。本专利技术的另一目的是提供菌株ZKGS01在防治植物真菌病害中的应用。鉴于中药材生产中，化学防治的农药残留及对环境的污染等问题，本专利技术从油菜根际中筛选分离出一株具有潜在的用于中药材病害生物防治的生防菌株ZKGS01。显微镜下观察ZKGS01菌体为椭圆形，杆状，能运动。在LB平板上，菌落淡乳白色，脓状，圆形，边缘整齐，菌落隆起呈馒头状，表面湿润；2-3天后菌落淡黄色，边缘不整齐，表面干燥有褶皱；在液体培养基中静止培养，表面形成白色菌膜。菌株ZKGS01的形态特征与《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等编著.科学出版社.2001年)中描述的芽孢杆菌属形态特征基本一致，初步判断菌株ZKGS01属于芽孢杆菌。菌株ZKGS01的16SrDNA序列如SEQIDNO:1所示，将其16SrDNA序列在GenBank中进行BLAST，并从NCBI公共数据库中下载不同芽孢菌种的16SrDNA序列进行比对，利用生物学软件构建菌株ZKGS01的聚类树(图1)，由聚类树可知，菌株ZKGS01的16SrDNA序列与枯草芽孢杆菌的标准菌株168的相似性最高，达99％。基于以上信息，将菌株ZKGS01鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。该菌现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCCNo.12456，保藏日期2016年5月16日。本专利技术还提供枯草芽孢杆菌ZKGS01在防治植物真菌病害中的应用。本专利技术所述植物包括中草药植物，优选金荞麦、勾藤、雷公藤、白补药、黄柏、太子参、何首乌等。本专利技术所述真菌病害的病原菌包括镰刀菌属病菌(Fusariumsp.)、芒果球座菌属病菌(Guignardiasp.)、丝核菌属病菌(Rhizoctoniasp.)、炭疽属病菌(Colletotrichumsp.)、链格孢属病菌(Alternariasp.)、葡柄霉属病菌(Stemphyliumsp.)等。优选地，所述真菌病害的病原菌包括镰刀菌(Fusariumoxysporum)、芒果球座菌(Guignardiamangiferae)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、互隔文链孢霉(Alternariaalternata)、茄匍柄霉菌(Stemphyliumsolani)、博宁刺盘孢菌(C.boninense)、蝴蝶兰炭疽菌(C.hymenocallidis)、毁灭炭疽菌(C.destructivum)等。前述的应用，其是将枯草芽孢杆菌ZKGS01的发酵液、菌体裂解液或孢子悬液接种至植物的根、茎、枝条、叶片上，进行真菌病害的生物防治。本专利技术还提供枯草芽孢杆菌ZKGS01在制备植物真菌病害的生防菌剂中的应用。本专利技术还提供由枯草芽孢杆菌ZKGS01制备的植物真菌病害的(复合)生防菌剂，其活性成分为枯草芽孢杆菌ZKGS01的发酵液、菌体裂解液或孢子悬液。例如，在本专利技术的一个具体实施方式中，在LB固体平板上活化菌株ZKGS01，挑取单菌落，接种至1L的LB液体培养基中，在37℃摇床上，转速为200rpm，培养24小时左右。用清水将菌液稀释至106-107cfu/mL，作为生防菌剂。本专利技术进一步提供菌株ZKGS01的突变体。对本领域技术人员来说，DNA突变或突变体筛选的方法，或者通过化学或酶的方法构建突变体是相对简单的。这些方法不仅限于紫外(UV)辐射诱变，也可以通过化学试剂如亚硝酸，1-甲基3-硝基-1-亚硝基胍(NG)、硝基氮氧化喹啉(4NQO)等，具体参见Leninger(1972)Biochemistry.WorthPublishersInc.,NY；JeffreyH.Miller(1972)\ExperimentsinMolecularGenetics.ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringsHarbor,NewYork进行诱变。优选采用UV和NG进行人工诱变。通过紫外辐射诱变，菌株ZKGS01的突变株可以产生抗菌物质。例如，孢子在紫外辐射10-180秒即可得到突变体，优选紫外辐射45-90秒，更优选65-75秒。利用NG诱变的效果与NG的浓度和诱变时间相关。例如在13-400mg/LNG中处理15-20分钟就可以得到突变体。也可以通过分子生物学或其他的手段得到突变体。利用分子生物学引起的突变不仅限于本文档来自技高网...

【技术保护点】
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZKGS01，其保藏编号为CGMCC No.12456。

【技术特征摘要】
1.枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)ZKGS01，其保藏编号为CGMCCNo.12456。2.权利要求1所述枯草芽孢杆菌ZKGS01在防治植物真菌病害中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述植物包括中草药植物，优选金荞麦、勾藤、雷公藤、白补药、黄柏、太子参、何首乌。4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述真菌病害的病原菌包括镰刀菌属病菌(Fusariumsp.)、芒果球座菌属病菌(Guignardiasp.)、丝核菌属病菌(Rhizoctoniasp.)、炭疽属病菌(Colletotrichumsp.)、链格孢属病菌(Alternariasp.)、葡柄霉属病菌(Stemphyliumsp.)。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述真菌病害的病原菌包括镰刀菌(Fusariumoxysporum)、芒果球座菌(Guignardiamangiferae)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、互隔文链孢霉(Alter...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅洪波，陈宇红，范成明，胡赞民，李将健，何红军，
申请(专利权)人：北京社祥科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11