一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体定量装置制造方法及图纸

一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体定量装置，属于免疫学检测领域。由储存5倍样品稀释液的容器、储存25倍洗液的容器、储存HNL/MMP‑9标准品浓度梯度冻干粉的容器、抗MMP‑9抗体包被的96孔酶标板和储存酶标抗HNL抗体溶液的容器或抗HNL抗体包被的96孔酶标板和储存酶标抗MMP‑9抗体溶液的容器、U型底96孔板、封板膜、储存酶底物溶液的容器及储存终止液的容器组成，所述HNL/MMP‑9标准品为人源HNL/MMP‑9。本实用新型专利技术特异性检出HNL/MMP‑9，而不检出游离MMP‑9、HNL及HNL同源二聚体。本装置使用孵育只需两步和清洗只需一步，显著缩短检测时间。因此，本装置具有特异性强和测试时间短等优点。本装置具有以HNL/MMP‑9为标志物诊断疾病(如乳腺癌)的实验室研究和潜在临床应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本技术属于免疫学检测
，具体涉及一种基于酶联免疫吸附(ELISA)技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体(HNL/MMP-9)快速定量装置。
技术介绍
人中性粒细胞脂质运载蛋白(humanneutrophillipocalin,HNL)也称中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophilgelatinaseassociatedlipocalin，NGAL)，是一脂质运载蛋白(J.Biol.Chem.1993,268:10425-10432；Scand.J.Clin.Lab.Invest.1994,54:365-376)。单体(momomer)、同源二聚体(homomer)及单体与MMP-9分子形成异源二聚体(HNL/MMP-9)是HNL在体液中的分子存在形式，不同分子形式HNL与不同的病理过程有关。如单体HNL可能与急性肾损伤有相对较高的相关性(Lancet2005,365:1231-1238；Am.J.Nephrol.2004,24:307-315)，HNL/MMP-9可能与肿瘤侵袭有关。CeciliaA.Fernandez等人研究发现HNL/MMP-9与乳腺癌存在相关性，具有作为乳腺癌诊断生物标准物的潜力(Clin.CancerRes.2005,11:5390-5395)。单独定量HNL方法已经有很多公开报道，如国际专利WO/1995/029404A1、欧洲专利EP2225268和中国专利ZL200980155194、ZL201220323587、ZL201420423962、201510184818等；定量MMP-9的方法如中国专利(申请号：201410180514.X)SPR(表面等离子共振)法检测溶液中的MMP-9,AndreaStaack等报道了酶联免疫吸附法(ELISA)定量MMP-9(BMCUrology2006,6:1-19)除R&DSystems公司有一款HNL/MMP-9定量试剂盒产品(DM9L20)外，至今没有其他关于HNL/MMP-9的准确定量方法相关专利和文献的报道。R&DSystemsHNL/MMP-9定量装置产品说明书表明采用该装置定量HNL/MMP-9需要用时约4.5小时，可见该产品十分费时。
技术实现思路
为了实现HNL/MMP-9分子的特异性快速定量，本技术设计并开发出基于酶联免疫吸附(ELISA)技术的HNL/MMP-9快速定量装置。该装置具有操作简单和使用快捷等优异性能，在HNL/MMP-9作为肿瘤等疾病生物标志物的实验室研究和未来临床应用方面具有极大应用潜力。为了实现上述目标，本技术采取以下技术方案：一种基于酶联免疫吸附技术(ELISA)的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体(HNL/MMP-9)快速定量装置，其特征在于：由储存5倍样品稀释液的容器、储存25倍洗液的容器、储存HNL/MMP-9标准品浓度梯度冻干粉的容器、抗MMP-9抗体包被的96孔酶标板和储存酶标抗HNL抗体溶液的容器或抗HNL抗体包被的96孔酶标板和储存酶标抗MMP-9抗体溶液的容器、U型底96孔板、封板膜、储存酶底物溶液的容器及储存终止液的容器组成，所述HNL/MMP-9标准品为人源HNL/MMP-9；所述酶标抗体所标记的酶可用辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等；所述定量装置是指经两步法可快速定量HNL/MMP-9，所述两步法快速定量HNL/MMP-9是指装置使用过程中孵育过程只需两次，所述两次孵育过程第一次是指将酶标抗HNL抗体加入抗MMP-9抗体包被的96孔酶标板或酶标抗MMP-9抗体加入到抗HNL抗体包被的96孔酶标板后快速加入标准品浓度梯度溶液和样品溶液后孵育20～40min，所述两次孵育过程第二次是指第一次孵育后将抗MMP-9抗体包被的96孔酶标板或抗HNL抗体包被的96孔酶标板经洗液工作液清洗后指加入酶底物溶液孵育10～20min后加入终止液。将5倍样品稀释液用去离子水稀释5倍获得样品稀释液工作液；将25倍洗液用去离子水稀释25倍制成洗液工作液；所述标准品浓度梯度溶液是指将HNL/MMP-9标准品浓度梯度冻干粉加入200μL样品稀释液工作液制成；所述样品溶液是指经样品稀释液工作液稀释后的体液样本，所述体液样本包括尿液、血清、血浆、脑脊液、唾液等。本技术装置具体组成、制备及使用方法如下：1)本技术装置组成表1为本技术装置的组成，图1和图2为个组成部分的示意图。表1：为本技术装置组成2)制备方法a)抗体包被的96孔酶标板的制备(1)抗体包被酶标板将抗MMP-9抗体或抗HNL抗体用25～100mmol/LNa2CO3-NaHCO3、pH9.6的碳酸钠缓冲液稀释到2～6μg/mL制成抗体包被液；向96孔酶标板每孔加100μL抗体包被液；37℃孵育2h、室温孵育4h或4℃过夜；抗MMP-9抗体可为商品化的抗MMP-9抗体(如Abcam的ab38898或ab51203等)或通过常规方法以MMP-9免疫动物制备的抗体或基因工程方法制备的抗MMP-9抗体，所述抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体。抗HNL抗体可为商品化的抗HNL抗体(如Abcam的ab63929、ab23477或P&MVengeDiagnosticsDevelopment公司的HNLmab697等)或通过常规方法(Currentprotocolsinmolecularbiology.NewYork:JohnWiley，200811.10.1-11.10.10)以人HNL免疫动物制备的抗体或基因工程方法制备的抗HNL抗体，所述抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体。(2)封闭酶标板弃包被液；向96孔酶标板每孔加200～300μL封闭液(封闭液为含2％BSA(wt/vol)的25～100mmol/LNa2CO3-NaHCO3,pH9.6的碳酸钠缓冲液)；37℃孵育2h、室温孵育4h或4℃过夜。(3)固定酶标板弃封闭液；向96孔酶标板每孔加200～300μL固定液(固定液为含50％蔗糖(wt/vol)、50％海藻糖(wt/vol)或25％蔗糖(wt/vol)和25％海藻糖(wt/vol)的50mmol/LNa2CO3-NaHCO3,pH9.6的碳酸钠缓冲液)；室温固定30min～2h。(4)密封酶标板弃固定液，室温晾干或25～30℃真空干燥；将酶标板和袋装干燥剂装进锡箔袋然后抽真空，4℃保存。b)5倍样品稀释液为含有2.5％BSA(wt/vol)、0.5％Tween-20(vol/vol)、0.5％十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)(wt/vol)、2％PEG-600(聚乙二醇600)(vol/vol)和0.1％NaN3(wt/vol)的磷酸根摩尔浓度为50mmol/L、pH7.4的PBS缓冲液；c)标准品浓度梯度冻干粉的制备标准品浓度梯度冻干粉为不同浓度HNL/MMP-9溶液制备的冻干粉，HNL/MMP-9以文献方法从中性粒细胞分离纯化获得(J.Biol.Chem.1993,268:10425-10432；Scand.J.Clin.Lab.Invest.1994,54:365-376)。具体是将10ng纯化本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体HNL/MMP‑9定量装置，其特征在于：由储存5倍样品稀释液的容器(51)、储存25倍洗液的容器(52)、储存HNL/MMP‑9标准品浓度梯度冻干粉的容器(54、55、56、57、58、59、60)、抗MMP‑9抗体包被的96孔酶标板(20)和储存酶标抗HNL抗体溶液的容器(53)或抗HNL抗体包被的96孔酶标板(20)和储存酶标抗MMP‑9抗体溶液的容器(53)、U型底96孔板(30)、封板膜(40)、储存酶底物溶液的容器(61、62)及储存终止液的容器(63)组成，所述HNL/MMP‑9标准品为人源HNL/MMP‑9；所述酶标抗体所标记的酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；所述标准品浓度梯度溶液是指HNL/MMP‑9标准品浓度梯度冻干粉加入200μL样品稀释液工作液制成；所述样品溶液是指经样品稀释液工作液稀释后的体液样本，所述体液样本为尿液、血清、血浆、脑脊液或唾液；所述样品稀释液工作液是将5倍样品稀释液用去离子水稀释5倍获得。

【技术特征摘要】
1.一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体HNL/MMP-9定量装置，其特征在于：由储存5倍样品稀释液的容器(51)、储存25倍洗液的容器(52)、储存HNL/MMP-9标准品浓度梯度冻干粉的容器(54、55、56、57、58、59、60)、抗MMP-9抗体包被的96孔酶标板(20)和储存酶标抗HNL抗体溶液的容器(53)或抗HNL抗体包被的96孔酶标板(20)和储存酶标抗MMP-9抗体溶液的容器(53)、U型底96孔板(30)、封板膜(40)、储存酶底物溶液的容器(61、62)及储存终止液的容器(63)组成，所述HNL/MMP-9标准品为人源HNL/MMP-9；所述酶标抗体所标记的酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；所述标准品浓...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡林君，杨津，姜春来，孔维，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：新型
国别省市：吉林;22