一株金龟子绿僵菌转基因菌株及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一株金龟子绿僵菌转基因菌株及其制备方法与应用，由金龟子绿僵菌基因与外源类枯草杆菌蛋白酶Pr1a基因融合构建的重组工程菌。该金龟子绿僵菌转基因菌株以金龟子绿僵菌为基础，利用Pgpd作为强的启动子，TTrpC作为终止子，Basta作为筛选标记，利用融合PCR的方法构建类枯草杆菌蛋白酶Pr1al过表达盒，然后制备真菌原生质体，利用CaCl2-PEG法进行基因工程改造，将过表达盒随机插入金龟子绿僵菌基因组中，进行过表达。本发明专利技术的金龟子绿僵菌转基因菌株对德国小蠊灭杀效果好，毒力较强，能够在短时间内实现对德国小蠊种群有效控制。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一株金龟子绿僵菌转基因菌株及其制备方法与应用，具体的涉及一种含有外源类枯草杆菌蛋白酶基因，经基因重组得到的金龟子绿僵菌及其制备方法与应用。
技术介绍
德国小蠊，俗称蟑螂，是常见的世界性卫生害虫之一，能够携带多种细菌、病毒及寄生虫卵，导致疾病的传播，其分泌物或死亡虫体还能导致严重的机体过敏。自传入国内以来，因其对栖息场所的适应性强、繁殖快，易对化学杀虫剂产生耐药性，对我国的侵害程度日趋严重。目前，对德国小蠊的防治仍以化学防治为主，但高毒、高残留的化学杀虫剂的长期大量使用引起了一系列的环境和食品安全问题，因此减少化学杀虫剂的使用势在必行，以生物防治为主的害虫防治策略逐渐受到广泛的重视。生物防治具有对人畜的安全性高，无公害，无残留，有利于保持生态平衡和环保等优点，而被认为是对付高抗害虫的最有前途的技术手段。金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)，属于半知菌亚门绿僵菌属，是一种昆虫内寄生菌物。它对寄主的侵染过程包括粘附、孢子萌发、穿透虫体、体内发育和致死，这一过程是附着胞、表皮降解酶和破坏菌素等物质的生理生化作用的综合结果，该菌通过体壁接触感染导致害虫死亡，在侵染昆虫体壁过程中分泌一系列的胞外水解酶如蛋白酶，几丁质酶等，降解昆虫体壁引起昆虫致病并死亡，其中研究最多的是胞外蛋白酶系。金龟子绿僵菌产生的胞外蛋白酶在入侵寄主体壁的过程中起重要作用，其产生水平和活性高低是决定金龟子绿僵菌侵染能力的重要因素。类枯草杆菌蛋白酶(subtilisin-like protease A，Prla)是胞外蛋白酶的一类，在降解昆虫体壁，并激活昆虫自毒免疫体系，引起害虫致病作用中起主要作用，已被证明是重要的致病因子。已有研究证实，组成性表达在穿透昆虫体壁过程中起重要作用的Pr1a类蛋白酶基因Pr1a显著提高了金龟子绿僵菌对烟草天蛾的毒力。自1973年Mishra和Tatum首次报道肌醇缺陷型粗糙链孢霉的DNA转化以来，丝状真菌遗传转化研究发展非常迅速，目前已有100多种丝状真菌实现了转化。转化方法包括CaCl2-PEG转化法，基因枪法，电激转化法及农杆菌介导转化法(ATMT)等。其中，CaCl2-PEG转化法以原生质体作为受体细胞，具有群体数量大、容易获得纯合性的转化子等优点，近年来在病原真菌的遗传转化中得到广泛应用。Bogo等通过PEG转化法，将带有苯菌灵抗性的质粒pBT6导入金龟子绿僵菌，转化率为0.8～6.9个转化子/μg DNA。Inglis等同样利用PEG介导转化法将pBT6质粒导入玫烟色拟青霉和淡紫拟青霉中。Sandhu等采用PEG介导法，成功的进行了白僵菌的遗传转化，线性和圆形的质粒Psv50的转化率分别为4和6个转化子/μgDNA。在德国小蠊生物防治的过程中，以昆虫病原真菌-绿僵菌ESC-1为主要成分的灭蟑盒(Biopath毒饵)较为成功，在实际应用中也取得了一定的效果，但昆虫病原真菌杀虫剂灭杀效果通常较慢，毒力较弱，难以短时间内实现对德国小蠊种群的有效控制。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种对德国小蠊灭杀效果好，毒力较强，能够在短时间内实现对德国小蠊种群有效控制的金龟子绿僵菌转基因菌株。该金龟子绿僵菌转基因菌株以金龟子绿僵菌为基础，利用Pgpd作为强启动子，TTrpC作为终止子，Basta作为筛选标记，利用融合PCR的方法构建类枯草杆菌蛋白酶Pr1a过表达盒，然后制备真菌原生质体，利用CaCl2-PEG介导法进行基因工程改造，将过表达盒随机插入金龟子绿僵菌基因组中，进行过表达，进一步增强其对德国小蠊的灭杀效果。本专利技术的另一目的是提供该金龟子绿僵菌转基因菌株在防治德国小蠊中的应用。为实现上述目的，本专利技术采用下述技术方案：一株金龟子绿僵菌转基因菌株，由金龟子绿僵菌基因与外源类枯草杆菌蛋白酶Pr1a基因融合构建的重组工程菌。具体的，上述金龟子绿僵菌转基因菌株的构建方法如下：(1)根据GenBank上登录号为EU526905的类枯草蛋白酶Pr1a基因的序列，设计PCR引物，引物序列如下：5'-aacatatgcatctgtctgctcttct-3'，如序列表中SEQ.ID.NO 1所示；5'-ggcctaggttaggcaccgttgtaggcaa-3'，如序列表中SEQ.ID.NO 2所示。根据上述引物序列，以金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)菌株基因组DNA为模板，扩增出Pr1a基因片段，片段长度为1378bp，序列片段如序列表中SEQ.ID.NO 3所示：(2)利用Pgpd作为强的启动子，TTrpC作为终止子，Basta作为筛选标记，利用融合PCR的方法构建过表达盒。(3)采用二级培养法收集金龟子绿僵菌菌丝体，制备金龟子绿僵菌湿菌丝原生质体；(4)将步骤(2)制备的过表达盒采用CaCl2-PEG介导法导入到步骤(3)制备的金龟子绿僵菌原生质体中，将过表达盒随机插入金龟子绿僵菌基因组中，进行过表达；(5)筛选分离basta抗性能够稳定遗传的金龟子绿僵菌重组菌株。步骤(2)中，用于扩增Pgpd启动子的引物序列为：M1号引物：CGGAGAATATGGAGCTTCATCG，如序列表中SEQ.ID.NO 4所示；M2号引物：AGAAGAGCAGACAGATGCATGGGAAAAGAAAGAGAAAAGA，如序列表中SEQ.ID.NO 5所示；用于扩增TTrpC终止子的引物序列为：M5号引物：ACAACGGCAACGGTGCCTAAGATCCACTTAACGTTACTGA，如序列表中SEQ.ID.NO 8所示；M6号引物：CAGTTCTTCTCGGCGTTAACCCAGGGGCTGGTGACGG，如序列表中SEQ.ID.NO 9所示；步骤(3)中，金龟子绿僵菌原生质体的制备方法为：以0.7mol/L的NaCI溶液作为渗透压稳定剂，20mL原生质体Buffer，30℃酶解处理5小时。本专利技术的金龟子绿僵菌重组菌株可以采用固体发酵法获取大量孢子用作防治德国小蠊的生防材料。采用固体发酵优化培养基进行发酵，固体发酵优化培养基配方：以大米为发酵物料，按质量比为1：0.3加入质量百分数为0.02％CuSO4、1％硝酸钠、1％微量元素混合液；培养条件为：发酵温度为26-28℃，初始pH值为5.5-6.5，发酵前期保持高湿，后期降湿，发酵周期12-15天，得率平均达到16亿孢子/克。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术的金龟子绿僵菌转基因菌株，通过过表达类枯草本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株金龟子绿僵菌转基因菌株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)根据GenBank上登录号为EU526905的类枯草蛋白酶Pr1a基因的序列，设计PCR引物，引物序列如下：5'‑aacatatgcatctgtctgctcttct‑3'，如序列表中SEQ.ID.NO 1所示；5'‑ggcctaggttaggcaccgttgtaggcaa‑3'，如序列表中SEQ.ID.NO 2所示；根据上述引物序列，以金龟子绿僵菌菌株基因组DNA为模板，扩增出Pr1a基因片段，序列片段如序列表中SEQ.ID.NO 3所示；(2)利用Pgpd作为强的启动子，TTrpC作为终止子，Basta作为筛选标记，利用融合PCR的方法构建过表达盒。(3)采用二级培养法收集金龟子绿僵菌菌丝体，制备金龟子绿僵菌湿菌丝原生质体；(4)将步骤(2)制备的过表达盒采用CaCl2‑PEG介导法导入到步骤(3)制备的金龟子绿僵菌原生质体中，将过表达盒随机插入金龟子绿僵菌基因组中，进行过表达；(5)筛选分离basta抗性能够稳定遗传的金龟子绿僵菌重组菌株。

【技术特征摘要】
1.一株金龟子绿僵菌转基因菌株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)根据GenBank上登录号为EU526905的类枯草蛋白酶Pr1a基因的序列，设计PCR
引物，引物序列如下：
5'-aacatatgcatctgtctgctcttct-3'，如序列表中SEQ.ID.NO 1所示；
5'-ggcctaggttaggcaccgttgtaggcaa-3'，如序列表中SEQ.ID.NO 2所示；
根据上述引物序列，以金龟子绿僵菌菌株基因组DNA为模板，扩增出Pr1a基因片段，序
列片段如序列表中SEQ.ID.NO 3所示；
(2)利用Pgpd作为强的启动子，TTrpC作为终止子，Basta作为筛选标记，利用融合
PCR的方法构建过表达盒。
(3)采用二级培养法收集金龟子绿僵菌菌丝体，制备金龟子绿僵菌湿菌丝原生质体；
(4)将步骤(2)制备的过表达盒采用CaCl2-PEG介导法导入到步骤(3)制备的金龟子
绿僵菌原生质体中，将过表达盒随机插入金龟子绿僵菌基因组中，进行过表达；
(5)筛选分离basta抗性能够稳定遗传的金龟子绿僵菌重组菌株。
2.如权利要求1所述的金龟子绿僵菌转基因菌株的制备方法，其特征在于，步骤(2)
中，用于扩增Pgpd启动子的引物序列为：
M1号引物：CGGAGAATATGGAGCTTCATCG，如序列表中SEQ.ID.NO 4所示；
M2号引物：AGAAGAGCAGACAGATG...

【专利技术属性】
技术研发人员：张凡，廖慧萍，张洁，刘新，祝金宝，卢敏，
申请(专利权)人：山东师范大学，
类型：发明
国别省市：山东;37