一种三联肽Cec Md3js、制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种三联肽Cec Md3js，用于编码所述三联肽Cec Md3js的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述三联肽Cec Md3js的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。利用该三联肽Cec Md3js制备的抗菌肽Cec Md对多种细菌具有抗菌活性、热稳定性好，且分离纯化简单、易操作，适于大规模工业化生产，该三联肽Cec Md3js在抗菌药物、食品抗菌剂、饲料添加剂等领域具有良好的应用前景。另外，本发明专利技术还提供了一种三联肽Cec Md3js的制备方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种三联肽CecMd3js、制备方法及应用。
技术介绍
抗菌肽是生物体抵御外界病原微生物入侵的有效屏障，具有广谱抗菌作用，而且具有不易产生耐药性的特点，在农业、医疗、食品、动物饲料等领域具有较好的应用前景。目前，已发现了上千种抗菌肽，但是能够应用于临床的抗菌肽种类依然有限。因此，人们希望通过分子设计和重新改造获得活性更好的新型抗菌肽。由于抗菌肽属于小分子肽，其克隆、表达、分离、纯化和检测工序都相对繁琐，为了提高目的蛋白的回收效率，有效的保持抗菌肽活性、降低宿主细胞毒性、增加抗菌肽稳定性和表达量，通常采用串联表达的方式来表达抗菌肽。天蚕素抗菌肽(cecropins)是目前研究最清楚、效果最好的天然抗菌肽；家蝇天蚕素抗菌肽(CecMd)与天蚕素抗菌肽的同源性达81％，但家蝇天蚕素抗菌肽仍具有一定的溶血活性，且分离纯化步骤繁琐。
技术实现思路
本专利技术提供的一种三联肽CecMd3js、制备方法及应用，利用该三联肽CecMd3js制备的抗菌肽CecMd溶血性低、抗菌活性高，该制备方法分离纯化步骤简单。本专利技术提供了一种三联肽CecMd3js，用于编码所述三联肽CecMd3js的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述三联肽CecMd3js的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术还提供了一种三联肽CecMd3js的制备方法，包括以下步骤：步骤1，合成核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的目的基因；步骤2，以限制性内切酶KpnⅠ和XbaⅠ双酶切载体pGAPZαA，并回收得到3147bp的载体片段；将所述目的基因和所述载体片段连接，得到含有重组载体pGAPZαA/CecMd3js的连接液；步骤3，将步骤2的连接液转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α中，并提取重组载体pGAPZαA/CecMd3js，得到重组载体pGAPZαA/CecMd3js；步骤4，将重组载体pGAPZαA/CecMd3js转化到宿主细胞中，得到表达工程菌；步骤5，培养步骤4的表达工程菌，进行三联肽CecMd3js的表达，并提取三联肽CecMd3js，得到三联肽CecMd3js。优选的，上述三联肽CecMd3js的制备方法中，步骤4的宿主细胞为毕赤酵母GS115。本专利技术还提供了一种三联肽CecMd3js，在制备抗菌肽CecMd中的应用。本专利技术还提供了一种三联肽CecMd3js，在制备治疗革兰氏阴性菌疾病药物或者治疗革兰氏阳性菌疾病药物中的应用。本专利技术还提供了一种三联肽CecMd3js，在制备动物饲料添加剂中的应用。本专利技术还一种利用所述三联肽CecMd3js制备抗菌肽CecMd的方法，具体包括以下步骤：步骤a，用pH8.0，0.01mol/L的PB缓冲液为溶剂，配制浓度为1mg/mL的三联肽CecMd3js溶液；然后配制体积分数为50％的甲酸溶液，将三联肽CecMd3js溶液与甲酸溶液按照1000:12的体积比例混合，50℃水浴36h，得到切割溶液；步骤b，用蒸馏水将切割溶液稀释3倍，真空冷冻干燥，得到固体抗菌肽；步骤c，用蒸馏水将固体抗菌肽复溶，再经真空冷冻干燥，得到抗菌肽CecMd粗品；步骤d，抗菌肽CecMd的纯化将抗菌肽CecMd粗品经5000kDa膜分离，得到的分离液经G50层析柱纯化，得到抗菌肽CecMd。本专利技术提供的一种三联肽CecMd3js，并应用基因工程技术在毕赤酵母中高效表达了该三联肽CecMd3js，经验证，利用该三联肽CecMd3js制备的抗菌肽CecMd溶血性低、对多种细菌具有抗菌活性、热稳定性好，表达量高，且分离纯化简单、易操作，适于大规模工业化生产，该三联肽CecMd3js在医药(抗菌药物)、食品(抗菌剂)、饲料添加剂等领域具有良好的应用前景。附图说明图1为重组载体pGAPZαA/CecMd3js的PCR产物鉴定电泳图；图2为重组载体pGAPZαA/CecMd3js的双酶切产物鉴定电泳图；图3为重组载体pGAPZαA/CecMd3js的线性化产物鉴定电泳图；图4为酵母转化子的菌落PCR鉴定电泳图；图5为三联肽CecMd3js的Tricine-SDS-PAGE分析图谱；图6为三联肽CecMd3js的高效液相色谱分析结果；图7为三联肽CecMd3js的质谱分析结果。其中，图1中M泳道为DNA标准分子量(Maker)，1、2号泳道均为重组载体pGAPZαA/CecMd3js的PCR产物(704bp)；图2中M泳道为DNA标准分子量(Maker)，1、2号泳道均为重组载体pGAPZαA/CecMd3js的双酶切产物(396bp)；图3中M泳道为DNA标准分子量(Maker)，1号泳道为重组载体pGAPZαA/CecMd3js的线性化产物(3543bp)；图4中M泳道为DNA标准分子量(Maker)，1号泳道为酵母转化子的菌落PCR产物(783bp)；图5中M泳道为标准蛋白Marker，1号泳道为三联肽CecMd3cs(13.91kDa)，2号泳道为三联肽CecMd3js(13.36kDa)，3号泳道为CecMd2cs(9.08kDa)，4号泳道为CecMd2js(8.79kDa)，5号泳道为二联肽CecMd2ys(8.77kDa)，6号泳道为抗菌肽CecMd(4.26kDa)，7号泳道为CecMd3jn样品上清液，8号泳道为CecMd3cn样品上清液，9号泳道为空白对照。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术进行详细说明，但应当理解本专利技术的保护范围并不受具体实施方式的限制。本专利技术提供了一种三联肽CecMd3js，用于编码所述三联肽CecMd3js的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述三联肽CecMd3js的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。基于同一种专利技术构思，本专利技术还提供了一种三联肽CecMd3js的制备方法，包括以下步骤：步骤1，合成核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的目的基因。需要说明的是，为了提高抗菌肽的表达量，采用串联设计，遵循毕赤酵母偏爱性原则，设计如SEQIDNO.1所示的用于编码三联肽CecMd3js的核苷酸序列，并在该序列的5’端添加KpnⅠ的限制性酶切位点GGTACC和起始密码子ATG；并在该序列3’端添加XbaⅠ的限制性酶切位点TCTAGA和终止密码子TAA，得到如SEQIDNO.3所示的目的基因。步骤2，以限制性内切酶KpnⅠ和XbaⅠ双酶切载体pGAPZαA，并回收得到3147bp的载体片段；将所述目的基因和所述载体片段连接，得到含有重组载体pGAPZαA/CecMd3js的连接液。具体包括以下步骤：步骤2.1，以限制性内切酶KpnⅠ和XbaⅠ双酶切载体pGAPZαA，载体pGAPZαA的双酶切体系如表1所示，得到载体双酶切溶液；取5μL载体双酶切溶液与1μL的6×LoadingBuffer混合均匀，在含有EB的1％琼脂糖电泳检测，电泳检测正确后，将剩下15μL的载体双酶切溶液按照DNA凝胶回收试剂盒方法进行胶回收，得到3147bp的载体片段。表1载体pGAPZαA的双酶切体系其中，双酶切的条件为：将表1所示双酶切体系中的各物质加入PCR管中混匀，于37℃水浴3h。步骤2.2，将所述目的基因和所述载体片段连接，其连接体系如本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种三联肽Cec Md3js，其特征在于，用于编码所述三联肽Cec Md3js的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述三联肽Cec Md3js的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种三联肽CecMd3js，其特征在于，用于编码所述三联肽CecMd3js的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述三联肽CecMd3js的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。2.一种权利要求1所述的三联肽CecMd3js的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，合成核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的目的基因；步骤2，以限制性内切酶KpnⅠ和XbaⅠ双酶切载体pGAPZαA，并回收得到3147bp的载体片段；将所述目的基因和所述载体片段连接，得到含有重组载体pGAPZαA/CecMd3js的连接液；步骤3，将步骤2的连接液转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α中，并提取重组载体pGAPZαA/CecMd3js，得到重组载体pGAPZαA/CecMd3js；步骤4，将重组载体pGAPZαA/CecMd3js转化到宿主细胞中，得到表达工程菌；步骤5，培养步骤4的表达工程菌，进行三联肽CecMd3js的表达，并提取三联肽CecMd3js，得到三联肽CecMd3js。3.根据权利要求2所述的三联肽CecMd3js的制备方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜宁，张爱忠，祁丽，张晨雪，张宇，李天阳，
申请(专利权)人：黑龙江八一农垦大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23