一种体外IAK免疫细胞培养方法技术

本发明专利技术属于肿瘤预防和治疗技术领域，具体涉及一种优化的体外IAK免疫细胞培养方法。该方法包括：提取外周血单个核细胞，然后随培养时间不同分步骤、分批次加入特殊设计的A、B、C、D试剂，并培养至特定时间等步骤。本发明专利技术通过对IAK免疫细胞体外培养体系进行优化，使得该技术在细胞扩增能力、效应细胞表型及比例、杀伤能力等指标方面保持一致或有了较好改进，尤其是效应细胞比例、效应细胞的杀伤能力有了明显改善，从而使得该技术能够更好的用于肿瘤治疗，因而具有较好的实用价值和推广应用意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于肿瘤预防和治疗
，具体涉及一种优化的体外IAK（Inducedactivatedkillercell，诱导活化杀伤细胞）免疫细胞培养方法。
技术介绍
自体细胞免疫疗法，是通过采血提取肿瘤患者体内不成熟的免疫细胞，在实验室中进行活化培养使其具有高效识别和杀伤肿瘤细胞的能力后，再回输给肿瘤患者体内。目前，体外细胞因子活化杀伤（Cytokine-inducedkillercell，CIK）免疫细胞的培养方法属于自体细胞免疫疗法的一种，用于治疗广谱的肿瘤患者。CIK疗法的技术原理为：将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子（如抗CD3单克隆抗体、IL-2和IFN-γ等）共同培养一段时间后获得的一群异质细胞；这群异质细胞中存在一类同时表达CD3+和CD56+两种膜蛋白分子的细胞，即NK细胞样T淋巴细胞（NKT细胞），是对肿瘤细胞具有杀伤作用的主要效应细胞。由于CIK细胞具有增殖速度快、对正常的细胞无毒性作用、杀瘤谱广、安全性高等特点。因此，应用CIK细胞被认为是抗肿瘤过继细胞免疫治疗的重要方案之一。然而，现有培养方法所制备的CIK细胞中，NKT细胞（效应细胞）比例较低，一般在10~30%左右，对杀伤肿瘤细胞的能力较为有限，因此，有必要进一步优化CIK细胞的培养方法，以提高免疫效应细胞的比例及杀瘤能力。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种优化的体外诱导活化杀伤的IAK免疫细胞培养方法，从而便于恶性肿瘤的预防和治疗。本专利技术所采取的技术方案详述如下。一种体外IAK免疫细胞培养方法，具体包括如下步骤：（1）提取外周血单个核细胞，具体为：采集肿瘤患者5mL外周血；1500rpm/min离心10min，上清液灭活后-20℃保存备用；将沉淀细胞用30mL生理盐水重悬后置于15mL淋巴细胞分离液上，进行密度梯度离心，收集单个核细胞并用生理盐水冲洗三次；所述密度梯度离心为2500rpm/min条件下，离心25min；（2）体外细胞培养，具体为：第0天：将步骤（1）所获得的外周血的单个核细胞平铺于24孔板中，每孔铺2×106个细胞，每孔加淋巴细胞培养基1mL；所述淋巴细胞培养基具体例如为Takara公司的GT-T551无血清培养基；然后加入A试剂，加入量（即终浓度）为10μL/mL，勿剧烈晃动培养板，按体积比5%比例加入自体血清（步骤（1）中离心灭活后上清液）；置于37℃、5%CO2的培养箱中进行培养；所述A试剂为溶解有IL-2和GM-CSF的GT-T551培养基，IL-2的浓度为100U/μL，GM-CSF的浓度为100U/μL；第2天：再次加入A试剂，加入量为10μL/mL，勿剧烈晃动培养板；第4天：吹打细胞并扩增至两个孔中（24孔板），淋巴细胞培养基1mL/孔，加入A试剂，加入量（即终浓度）为10μL/mL，自体血清5%；第5天：加入B和C试剂，加入量（即终浓度）均为10μL/mL，B试剂注意避光；所述B试剂为溶解有7DW8-5的GT-T551培养基，其中7DW8-5的浓度为1ng/μL；所述C试剂为溶解有IFN-γ、IL-2和CD3单抗的GT-T551培养基，其中IFN-γ的浓度为100U/μL，IL-2的浓度为200U/μL，CD3单抗的浓度为5ng/μL；第7天：吹打细胞并扩增至6孔板中，GT-T551培养基3~5mL/孔，视细胞量而定，加入D试剂，加入量（即终浓度）为10μL/mL，自体血清5%；所述D试剂为溶解有IL-2的GT-T551培养基，其中IL-2的浓度为100U/μL；第10天：吹打细胞并进一步扩增，视细胞量而定具体扩增体积，加入D试剂，加入量为10μL/mL，自体血清5%；第13~14天：收集细胞，检测细胞免疫表型和杀伤功能，从而对培养结果做出准确评价。培养结束后，对细胞免疫表型的检测，可采用流式细胞技术对细胞表面CD3、CD4、CD8、CD56的表达水平进行具体检测，由于NKT、NK细胞是非特异性免疫细胞培养体系中主要的效应细胞，因而通过CD3、CD4、CD8、CD56表达水平来表明体外诱导培养的IAK细胞中NKT、NK等细胞的比例情况；对细胞杀伤功能的检测，主要是利用流式细胞术检测细胞表面CD107a的表达水平，通过CD107a的表达水平来表明体外诱导培养的IAK细胞的杀伤功能情况。与传统的CIK培养方法相比，本专利技术通过对IAK免疫细胞体外培养体系进行优化，使得该技术在细胞扩增能力、效应细胞表型及比例、杀伤能力等指标方面保持一致或有了较好改进，具体而言如下：1.细胞扩增能力保持了一致：传统CIK培养方法大约可扩增细胞100~1000倍左右，本专利技术所提供的培养方法中的细胞增殖能力与传统CIK培养方法保持了一致，细胞扩增倍数保持在大约100~1000倍左右，因而使得该方法具备了潜在的应用前景；2.效应细胞表型及比例有明显改善：CIK细胞以NK细胞样T细胞（NKT细胞，即CD3+CD56+细胞）为主要效应细胞来杀伤肿瘤细胞，但比例一般在10~30%之间；本专利技术的IAK细胞中效应细胞以NKT细胞（CD3+CD56+细胞）和NK细胞（CD3-CD56+细胞）为主，其中NKT细胞比例为（46.5±17.8）%，NK细胞比例为（28.1±17.5）%，两群细胞比例之和最高可达90%以上，不论是单独的NKT或NK细胞比例，还是NKT与NK细胞比例之和，均较传统CIK法中的相应效应细胞比例明显提高；另外，在大样本实验中观察到，IAK细胞中CD8+/CD3+T细胞比例较传统CIK细胞明显增高；因而使得本专利技术具有潜在的更好的杀伤肿瘤效果；3.细胞伤杀能力改善明显：免疫效应细胞对肿瘤靶细胞进行攻击的时候，会分泌CD107a蛋白（溶酶体相关膜蛋白），从而释放穿孔素、颗粒酶以对靶细胞进行杀伤，因此CD107a的表达水平情况可以代表效应细胞杀伤肿瘤细胞的能力；我们研究发现，传统CIK细胞中CD107a+细胞比例一般为（17.9±7.6）%左右，而本专利技术的IAK细胞中CD107a+细胞比例为（28.4±6.9）%左右；本专利技术的IAK细胞CD107a表达水平明显高于现有技术，即，本专利技术的IAK细胞的杀瘤能力明显强于传统的CIK细胞。总体而言，本专利技术通过IAK免疫细胞体外培养体系进行优化，使得效应细胞比例、效应细胞的杀伤能力有了明显改善，从而使得该技术能够更好的用于肿瘤治疗，因而具有较好的实用价值和推广应用意义。附图说明图1为IAK细胞培养流程图；图2为实验组与对照组NKT细胞比例情况对比；图3为实验组与对照组NK细胞比例情况对比；图4为实验组与对照组CD107a细胞比例情况对比；图5为一例大样本实验组与对照组流式细胞图对比；图6为IAK1、IAK2组与对照组NKT细胞比例情况对比；图7为IAK1、IAK2组与对照组NK细胞比例情况对比。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，对本专利技术中部分实验试剂、实验设备等情况简要介绍如下。样品患者来源：外周血样品来源于随机抽取的肿瘤患者（包括但不限于肺癌、食管癌、胃癌、结直肠癌、恶性黑色素瘤、乳腺癌等，肿瘤患者不限制年龄、性别、TNM分期等临床参数）自愿者，实验过程中，将同一患者的外周血平均分为两本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种体外IAK免疫细胞培养方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：（1）提取外周血单个核细胞，具体为：采集肿瘤患者外周血，离心，取沉淀细胞，同时将上清液，即自体血清，灭活备用；沉淀细胞用生理盐水重悬后置于淋巴细胞分离液上，进行密度梯度离心，收集单个核细胞并用生理盐水冲洗干净备用；（2）体外细胞培养，具体为：第0天：将步骤（1）所获得的单个核细胞，按每2×106个细胞加淋巴细胞培养基1mL的比例，加入淋巴细胞培养基；然后加入A试剂，再加入步骤（1）中灭活后上清液，进行培养；所述A试剂为溶解有IL‑2和GM‑CSF的淋巴细胞培养基，IL‑2的浓度为100U/μL，GM‑CSF的浓度为100U/μL；第2天：再次加入A试剂；第4天：吹打细胞并进行扩增，加入淋巴细胞培养基后，再加入A试剂及步骤（1）中灭活后上清液；第5天：加入B和C试剂；所述B试剂为溶解有7DW8‑5的淋巴细胞培养基，其中7DW8‑5的浓度为1ng/μL；所述C试剂为溶解有IFN‑γ、IL‑2 和CD3单抗的淋巴细胞培养基，其中IFN‑γ的浓度为100U/μL，IL‑2的浓度为200U/μL，CD3单抗的浓度为5ng/μL；第7天：吹打细胞进行扩增，加入淋巴细胞培养基后，然后加入D试剂，再加入步骤（1）中灭活后上清液；所述D试剂为溶解有IL‑2的淋巴细胞培养基，其中IL‑2的浓度为100U/μL；第10天：重复“第7天”的操作步骤，以对细胞进行进一步扩增；第13~14天：收集细胞，检测细胞免疫表型和杀伤功能，从而对培养结果做出评价。...

【技术特征摘要】
1.一种体外IAK免疫细胞培养方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：（1）提取外周血单个核细胞，具体为：采集肿瘤患者外周血，离心，取沉淀细胞，同时将上清液，即自体血清，灭活备用；沉淀细胞用生理盐水重悬后置于淋巴细胞分离液上，进行密度梯度离心，收集单个核细胞并用生理盐水冲洗干净备用；（2）体外细胞培养，具体为：第0天：将步骤（1）所获得的单个核细胞，按每2×106个细胞加淋巴细胞培养基1mL的比例，加入淋巴细胞培养基；然后加入A试剂，再加入步骤（1）中灭活后上清液，进行培养；所述A试剂为溶解有IL-2和GM-CSF的淋巴细胞培养基，IL-2的浓度为100U/μL，GM-CSF的浓度为100U/μL；第2天：再次加入A试剂；第4天：吹打细胞并进行扩增，加入淋巴细胞培养基后，再加入A试剂及步骤（1）中灭活后上清液；第5天：加入B和C试剂；所述B试剂为溶解有7DW8-5的淋巴细胞培养基，其中7DW8-5的浓度为1ng/μL；所述C试剂为溶解有...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨黎，张毅，
申请(专利权)人：郑州大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：河南;41