一种用于展示目的多肽的多肽载体及其用途制造技术

本发明专利技术涉及一种用于展示目的多肽的多肽载体及其用途。具体而言，本发明专利技术涉及一种核酸分子，其包含编码多肽载体的核苷酸序列，且用于插入编码目的多肽的核苷酸序列。此外，本发明专利技术还涉及包含所述多肽载体和目的多肽的重组蛋白。进一步，本发明专利技术还涉及，所述核酸分子和所述重组蛋白的用途。此外，本发明专利技术还特别涉及，可用于预防、减轻或治疗HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)的疫苗或药物组合物，其包含含有本发明专利技术的多肽载体和来自HBV的表位的重组蛋白。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程疫苗领域、分子病毒学领域和免疫学领域。此外，本专利技术还特别涉及乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus,HBV)感染治疗领域。具体而言，本专利技术涉及一种核酸分子，其包含编码多肽载体(peptidecarrier)的核苷酸序列，且用于插入编码目的多肽的核苷酸序列。特别地，本专利技术的所述核酸分子在插入编码目的多肽的核苷酸序列且表达为重组蛋白后，所述多肽载体能够展示所述目的多肽(例如目的抗原或抗原中的目的表位)，和/或，所述重组蛋白能够形成病毒样颗粒并展示所述目的多肽。此外，本专利技术还涉及包含所述多肽载体以及目的多肽的重组蛋白。进一步，本专利技术还涉及，所述核酸分子和所述重组蛋白的用途。此外，本专利技术还特别涉及，可用于预防、减轻或治疗HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)的疫苗或药物组合物，其包含含有本专利技术的多肽载体和来自HBV的表位的重组蛋白。
技术介绍
疫苗是应对传染病的有效手段。根据适用人群的不同，疫苗可分为预防性疫苗和治疗性疫苗。预防性疫苗主要应用于预防病毒感染，包括减毒疫苗、灭活疫苗、基因工程疫苗，其主要通过诱导机体产生中和抗体来保护机体不被病毒感染。治疗性疫苗主要应用于治疗持续性病毒感染以及肿瘤等疾病。在这些疾病中，患者对于靶抗原通常表现为免疫耐受的状态，因此，研发人员尝试通过多种形式的疫苗来诱导机体产生针对靶抗原的有效免疫应答。治疗性疫苗主要包括核酸疫苗、病毒载体疫苗、基因工程疫苗等，其中基因工程疫苗具有明显的优势。已上市的基因工程疫苗包括乙型肝炎病毒疫苗、人乳头瘤病毒(HumanPapillomavirus，HPV)疫苗、戊型肝炎病毒(HepatitisEvirus，HEV)疫苗，它们均为病毒样颗粒(virus-likeparticles,VLPs)的形式。病毒样颗粒是指，由某种病毒的一个或多个结构蛋白构成的空心颗粒，其不包含病毒核酸，不能进行自主复制，但在形态上与真正的病毒粒子相同或相似。病毒样颗粒具有以下优点：免疫原性强、安全性好、不易失活、可展示外源肽段并诱导机体产生针对外源肽段的特异性免疫应答，因此，在疫苗领域具有重要的应用价值。目前，全球约有20亿人感染过HBV，其中约有3.5亿的慢性HBV感染者，这些感染者最终死于HBV感染相关肝脏疾病的风险可达15％-25％。全球每年超过100万人死于乙肝导致的终末期肝病。我国是HBV感染的重灾区，目前约有9300万乙肝携带者。近年来，随着病例报告系统不断健全，乙肝相关疾病的发生率，病死率不降反升。当前针对慢性HBV感染的治疗药物主要可分为两类，即干扰素类(Interferon)和核苷/核苷酸类似物(NAs)。慢性HBV感染的治疗的最终目标是，阻止重症肝炎(肝衰竭)、肝硬化和肝癌等终末期肝脏疾病的发生；其临床最佳治疗终点是，使患者达到乙型肝炎病毒表面抗原的血清学阴转或血清学转换，即完全清除HBV。但现有药物实现该目标的疗效十分有限。因此，针对慢性HBV感染者开发新的、能更有效地清除病毒、尤其是能有效清除HBsAg或大幅降低HBsAg水平的创新型治疗药物和方法是迫切而必要的，并且，研发治疗性疫苗是具有一定潜力的策略。
技术实现思路
本申请专利技术人基于三种蝙蝠来源的乙型肝炎病毒核心抗原蛋白(即，蹄蝠乙型肝炎病毒(roundleafbatHBV，RBHBV)的核心抗原蛋白(RBHBcAg)；筑帐蝠乙型肝炎病毒(tent-makingbatHBV，TBHBV)的核心抗原蛋白(TBHBcAg)；菊头蝠乙型肝炎病毒(horseshoebatHBV，HBHBV)的核心抗原蛋白(HBHBcAg))，开发了一类新的用于展示目的多肽的多肽载体(peptidecarrier)。由此，本专利技术提供了一种核酸分子，其含有编码多肽载体的核苷酸序列。此类核酸分子能够插入编码目的多肽的核苷酸序列，并表达为含有多肽载体和目的多肽(例如目的抗原，或抗原中的目的表位)的重组蛋白。进一步，所产生的重组蛋白能够有效形成VLP，并能够在VLP表面展示插入其中的目的多肽，从而所述目的多肽能够有效地被机体的免疫系统识别，诱发机体产生针对目的多肽的特异性免疫应答。因此，本专利技术的多肽载体可用作疫苗载体，用于展示目的多肽，例如来自目的抗原的肽段(例如表位)；并且，包含本专利技术的多肽载体和目的多肽的重组蛋白可用作疫苗，用于诱发机体产生针对目的多肽的特异性免疫应答。此外，本申请的专利技术人还出人意料地发现，RBHBcAg蛋白、TBHBcAg蛋白和HBHBcAg蛋白的C端均为富含精氨酸的区域，其对于VLP组装不是必须的。因此，本专利技术的多肽载体可以不包含RBHBcAg蛋白、TBHBcAg蛋白和HBHBcAg蛋白的C端区域。例如，本专利技术的RBHBcAg载体可以缺失RBHBcAg蛋白的第145-189位氨基酸的部分或全部(例如，缺失RBHBcAg蛋白的第150-189位氨基酸)；本专利技术的TBHBcAg载体可以缺失TBHBcAg蛋白的第149-188位氨基酸的部分或全部(例如，缺失TBHBcAg蛋白的第154-188位氨基酸)；本专利技术的HBHBcAg载体可以缺失HBHBcAg蛋白的第145-189位氨基酸的部分或全部(例如，缺失HBHBcAg蛋白的第150-189位氨基酸)。此外，本申请的专利技术人还出人意料地发现，本专利技术的多肽载体特别适合用于展示来自人乙肝病毒的抗原表位(例如来自人HBV的HBsAg中的表位)，能够在受试者中诱发特别强的清除HBsAg的特异性免疫应答，其功效显著优于现有的乙肝疫苗(例如，以人HBV的HBcAg为多肽载体构建的、含有相同表位的疫苗)。因此，本专利技术还提供了一种特别适合用于展示来自人乙肝病毒的抗原表位的多肽载体。因此，在一个方面，本专利技术提供了一种核酸分子，其包含编码多肽载体的核苷酸序列或者其变体，所述变体与所述核苷酸序列具有至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％)的同一性，或者在严紧条件或者高严紧条件下，能够与所述核苷酸序列杂交，其中，所述多肽载体选自：(1)RBHBcAg载体，其与蹄蝠乙型肝炎病毒的核心抗原蛋白(RBHBcAg；例如，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示)的区别在于：(a)RBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，5个或6个氨基酸残基；例如，第78-83位氨基酸残基、第78-82位氨基酸残基、第78-81位氨基酸残基、或第78-80位氨基酸残基)被缺失或被置换为连接体(例如，柔性连接体；例如，如SEQIDNO:43所示的连接体)；以及(b)任选地，RBHBcAg蛋白的C端缺失1-40个氨基酸残基(例如，1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-25个，25-30个，30-35个，或35-40个氨基酸残基)；(2)TBHBcAg载体，其与筑帐蝠乙型肝炎病毒的核心抗原蛋白(TBHBcAg；例如，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示)的区别在于：(a)TBHBcAg蛋白的N端第80-84位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个或5个氨基酸残基；例如，第80-84位氨基酸残基、第80-83位氨基酸残基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核酸分子，其包含编码多肽载体的核苷酸序列或者其变体，所述变体与所述核苷酸序列具有至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％)的同一性，或者在严紧条件或者高严紧条件下，能够与所述核苷酸序列杂交，其中，所述多肽载体选自：(1)RBHBcAg载体，其与蹄蝠乙型肝炎病毒的核心抗原蛋白(RBHBcAg；例如，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)的区别在于：(a)RBHBcAg蛋白的N端第78‑83位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，5个或6个氨基酸残基；例如，第78‑83位氨基酸残基、第78‑82位氨基酸残基、第78‑81位氨基酸残基、或第78‑80位氨基酸残基)被缺失或被置换为连接体(例如，柔性连接体；例如，如SEQ ID NO:43所示的连接体)；以及(b)任选地，RBHBcAg蛋白的C端缺失1‑40个氨基酸残基(例如，1‑5个，5‑10个，10‑15个，15‑20个，20‑25个，25‑30个，30‑35个，或35‑40个氨基酸残基)；(2)TBHBcAg载体，其与筑帐蝠乙型肝炎病毒的核心抗原蛋白(TBHBcAg；例如，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)的区别在于：(a)TBHBcAg蛋白的N端第80‑84位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个或5个氨基酸残基；例如，第80‑84位氨基酸残基、第80‑83位氨基酸残基、或第80‑82位氨基酸残基)被缺失或被置换为连接体(例如，柔性连接体；例如，如SEQ ID NO:43所示的连接体)；以及(b)任选地，TBHBcAg蛋白的C端缺失1‑35个氨基酸残基(例如，1‑5个，5‑10个，10‑15个，15‑20个，20‑25个，25‑30个，或30‑35个氨基酸残基)；或(3)HBHBcAg载体，其与菊头蝠乙型肝炎病毒的核心抗原蛋白(HBHBcAg；例如，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示)的区别在于：(a)HBHBcAg蛋白的N端第78‑83位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，5个或6个氨基酸残基；例如，第78‑83位氨基酸残基、第78‑82位氨基酸残基、第78‑81位氨基酸残基、或第78‑80位氨基酸残基)被缺失或被置换为连接体(例如，柔性连接体；例如，如SEQ ID NO:43所示的连接体)；以及(b)任选地，HBHBcAg蛋白的C端缺失1‑40个氨基酸残基(例如，1‑5个，5‑10个，10‑15个，15‑20个，20‑25个，25‑30个，30‑35个，或35‑40个氨基酸残基)；优选地，在编码所述被缺失的一个或多个氨基酸残基的位置处引入限制性酶切位点；优选地，在编码所述连接体的核苷酸序列中和/或其一端或两端引入限制性酶切位点；优选地，所述多肽载体的氨基酸序列选自SEQ ID NO:4‑9；优选地，所述核酸分子包含选自SEQ ID NO:12‑17的核苷酸序列；优选地，所述核酸分子用于插入编码目的多肽的核苷酸序列，例如所述编码目的多肽的核苷酸序列被插入至编码所述被缺失的一个或多个氨基酸残基的位置处，或者被插入至编码所述连接体的核苷酸序列中或其一端或两端(例如，通过限制性酶切位点)；优选地，所述核酸分子还包含，编码目的多肽的核苷酸序列，其中，所述目的多肽相对于所述多肽载体而言是异源的，并且所述编码目的多肽的核苷酸序列被插入至编码所述被缺失的一个或多个氨基酸残基的位置处，或者被插入至编码所述连接体的核苷酸序列中或其一端或两端(例如，通过限制性酶切位点)；优选地，所述目的多肽是表位肽，例如包含来自HIV、PDL1或HBV(特别是人HBV)的抗原表位的表位肽；优选地，所述表位肽包含：人HBV(例如HBV基因型A、B、C或D)的HBsAg的表位(例如线性表位，例如HBsAg蛋白的第113‑135位氨基酸)，HIV的GP120蛋白的表位(例如线性表位，例如GP120蛋白的第361‑375位氨基酸)，或人PD‑L1的表位(例如线性表位，例如人PD‑L1蛋白的第147‑160位氨基酸)；优选地，所述目的多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:20‑22和60‑62；优选地，所述核酸分子包含或者由编码选自SEQ ID NO:23‑40和69‑74的氨基酸序列的核苷酸序列组成。...

【技术特征摘要】
2015.08.25 CN 20151052318781.一种核酸分子，其包含编码多肽载体的核苷酸序列或者其变体，所述变体与所述核苷酸序列具有至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％)的同一性，或者在严紧条件或者高严紧条件下，能够与所述核苷酸序列杂交，其中，所述多肽载体选自：(1)RBHBcAg载体，其与蹄蝠乙型肝炎病毒的核心抗原蛋白(RBHBcAg；例如，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示)的区别在于：(a)RBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，5个或6个氨基酸残基；例如，第78-83位氨基酸残基、第78-82位氨基酸残基、第78-81位氨基酸残基、或第78-80位氨基酸残基)被缺失或被置换为连接体(例如，柔性连接体；例如，如SEQIDNO:43所示的连接体)；以及(b)任选地，RBHBcAg蛋白的C端缺失1-40个氨基酸残基(例如，1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-25个，25-30个，30-35个，或35-40个氨基酸残基)；(2)TBHBcAg载体，其与筑帐蝠乙型肝炎病毒的核心抗原蛋白(TBHBcAg；例如，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示)的区别在于：(a)TBHBcAg蛋白的N端第80-84位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个或5个氨基酸残基；例如，第80-84位氨基酸残基、第80-83位氨基酸残基、或第80-82位氨基酸残基)被缺失或被置换为连接体(例如，柔性连接体；例如，如SEQIDNO:43所示的连接体)；以及(b)任选地，TBHBcAg蛋白的C端缺失1-35个氨基酸残基(例如，1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-25个，25-30个，或30-35个氨基酸残基)；或(3)HBHBcAg载体，其与菊头蝠乙型肝炎病毒的核心抗原蛋白(HBHBcAg；例如，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示)的区别在于：(a)HBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，5个或6个氨基酸残基；例如，第78-83位氨基酸残基、第78-82位氨基酸残基、第78-81位氨基酸残基、或第78-80位氨基酸残基)被缺失或被置换为连接体(例如，柔性连接体；例如，如SEQIDNO:43所示的连接体)；以及(b)任选地，HBHBcAg蛋白的C端缺失1-40个氨基酸残基(例如，1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-25个，25-30个，30-35个，或35-40个氨基酸残基)；优选地，在编码所述被缺失的一个或多个氨基酸残基的位置处引入限制性酶切位点；优选地，在编码所述连接体的核苷酸序列中和/或其一端或两端引入限制性酶切位点；优选地，所述多肽载体的氨基酸序列选自SEQIDNO:4-9；优选地，所述核酸分子包含选自SEQIDNO:12-17的核苷酸序列；优选地，所述核酸分子用于插入编码目的多肽的核苷酸序列，例如所述编码目的多肽的核苷酸序列被插入至编码所述被缺失的一个或多个氨基酸残基的位置处，或者被插入至编码所述连接体的核苷酸序列中或其一端或两端(例如，通过限制性酶切位点)；优选地，所述核酸分子还包含，编码目的多肽的核苷酸序列，其中，所述目的多肽相对于所述多肽载体而言是异源的，并且所述编码目的多肽的核苷酸序列被插入至编码所述被缺失的一个或多个氨基酸残基的位置处，或者被插入至编码所述连接体的核苷酸序列中或其一端或两端(例如，通过限制性酶切位点)；优选地，所述目的多肽是表位肽，例如包含来自HIV、PDL1或HBV(特别是人HBV)的抗原表位的表位肽；优选地，所述表位肽包含：人HBV(例如HBV基因型A、B、C或D)的HBsAg的表位(例如线性表位，例如HBsAg蛋白的第113-135位氨基酸)，HIV的GP120蛋白的表位(例如线性表位，例如GP120蛋白的第361-375位氨基酸)，或人PD-L1的表位(例如线性表位，例如人PD-L1蛋白的第147-160位氨基酸)；优选地，所述目的多肽的氨基酸序列选自SEQIDNO:20-22和60-62；优选地，所述核酸分子包含或者由编码选自SEQIDNO:23-40和69-74的氨基酸序列的核苷酸序列组成。2.一种载体(例如克隆载体或表达载体)，其包含权利要求1的核酸分子。3.一种宿主细胞，其包含权利要求1的核酸分子或权利要求2的载体。4.一种展示目的多肽的方法，其包括:(1)将编码所述目的多肽的核苷酸序列插入至权利要求1的核酸分子中，从而获得编码重组蛋白的核酸分子；优选地，所述编码目的多肽的核苷酸序列被插入至编码所述被缺失的一个或多个氨基酸残基的位置处，或者被插入至编码所述连接体的核苷酸序列中或其一端或两端(例如，通过限制性酶切位点)；和(2)将步骤(1)中的编码重组蛋白的核酸分子表达为重组蛋白；优选地，所述目的多肽是表位肽，例如包含来自HIV、PDL1或HBV(特别是人HBV)的抗原表位的表位肽；优选地，所述表位肽包含：人HBV(例如HBV基因型A...

【专利技术属性】
技术研发人员：张天英，袁权，郭雪染，张莹，赵勤俭，张军，夏宁邵，
申请(专利权)人：厦门大学，厦门万泰沧海生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35