一种利用甲基化酶的保护高效重组表达限制性内切酶的方法技术

本发明专利技术是一种利用甲基化酶的保护高效重组表达限制性内切酶的方法，其特征在于：所述的甲基化酶是M.Sss I；所述限制性内切酶D选自：AatII、AciI、AclI、AfeI、AgeI、AscI、AsiSI、AvaI、BceAI、BmgBI、BsaAI、BsaHI、BsiEI、BsiWI、BsmBI、BspDI、BspEI、BsrFI、BssHII、BstBI、BstUI、BtgZI、ClaI、EagI、FauI、FseI、FspI、HaeII、HgaI、HhaI、HinP1I、HpaII、Hpy99I、HpyCH4IV、KasI、MluI、NaeI、NarI、NgoMIV、NotI、NruI、Nt.BsmAI、Nt.CviPII、PaeR7I、PluTI、PmlI、PvuI、RsrII、SacII、SalI、SfoI、SgrAI、SmaI、SnaBI、TliI、TspMI、XhoI、XmaI、ZraI。本发明专利技术方法重组工程菌的构建过程中直接使用广谱保护型甲基化酶M.Sss I，无需针对单个限制性内切酶进行繁琐的甲基化酶基因筛选，应用范围广泛，大大简化了重组表达过程。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程领域，特别是一种利用甲基化酶的保护高效重组表达限制性内切酶的方法。
技术介绍
限制性内切酶是当代基因工程研究不可缺少的重要工具，它们来源于不同的微生物，是细菌防御外来病毒入侵的武器。在20世纪60年代，科学家推测细菌中有限制-修饰系统（restriction-modificationsystem，R-Msystem），该系统包括两类酶，即限制性内切酶和DNA甲基化酶，前者负责降解进入原核细胞的外源DNA，后者则对细胞自身的DNA进行甲基化，从而保护细胞的DNA，使其不被细胞内的限制性核酸内切酶降解。现有技术中生产限制性内切酶的方法主要是将限制-修饰基因克隆入质粒，靠质粒的高拷贝数实现目的蛋白高表达，而且使用的是与限制性内切酶对应的特异性甲基化酶进行制备，这种方法的提纯程序繁琐、限制性内切酶得率低、生产成本高，获得的甲基化保护菌株只能特异性保护宿主DNA免于某一种限制性内切酶的切割，应用范围狭窄。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提出了一种利用甲基化酶的保护高效重组表达限制性内切酶的方法，可以应用于多种限制性内切酶的生产，降低了生产成本并且能够获得纯度高、活力好的限制性内切酶。本专利技术要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的，一种利用甲基化酶的保护高效重组表达限制性内切酶的方法，其特点是：所述的甲基化酶是M.SssI；所述限制性内切酶D选自：AatII、AciI、AclI、AfeI、AgeI、AscI、AsiSI、AvaI、BceAI、BmgBI、BsaAI、BsaHI、BsiEI、BsiWI、BsmBI、BspDI、BspEI、BsrFI、BssHII、BstBI、BstUI、BtgZI、ClaI、EagI、FauI、FseI、FspI、HaeII、HgaI、HhaI、HinP1I、HpaII、Hpy99I、HpyCH4IV、KasI、MluI、NaeI、NarI、NgoMIV、NotI、NruI、Nt.BsmAI、Nt.CviPII、PaeR7I、PluTI、PmlI、PvuI、RsrII、SacII、SalI、SfoI、SgrAI、SmaI、SnaBI、TliI、TspMI、XhoI、XmaI、ZraI。本专利技术所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。以上所述的利用甲基化酶的保护高效重组表达限制性内切酶的方法，包括：步骤（一）：将M.SssI基因克隆至质粒载体pACYC184上，得到M.SssI组成型质粒，转化宿主菌，筛选获得被甲基化保护的阳性重组菌株；步骤（二）：将所述限制性内切酶D的基因克隆至质粒载体pET-28b上，得到限制性内切酶D重组质粒，转化步骤（一）得到的已被甲基化保护的阳性重组菌，筛选稳定、可诱导、高表达的限制性内切酶D的重组表达菌株。本专利技术所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。以上所述的利用甲基化酶的保护高效重组表达限制性内切酶的方法中，所述的宿主菌为原核宿主细胞。进一步优选地，所述的宿主菌为大肠杆菌。本专利技术所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。以上所述的利用甲基化酶的保护高效重组表达限制性内切酶的方法中，所述的步骤（一）和步骤（二）分别包括：步骤（一）：设计引物，根据设计的引物PCR扩增M.SssI基因，M.SssI的PCR产物经纯化、酶切后连接至质粒载体pACYC184上，连接产物转化至DH5α感受态细胞中，经细胞培养后提取质粒，经测序获得M.SssI的组成型质粒pACYC184-M.SssI，将pACYC184-M.SssI转化大肠杆菌ER2566感受态细胞后，涂布于含氯霉素的LB平板上筛选克隆，获得M.SssI组成型表达菌株ER2566-M.SssI；步骤（二）：（1）限制性内切酶D重组表达菌株的构建设计引物，根据设计的引物PCR扩增限制性内切酶D基因，限制性内切酶D的PCR产物经纯化、酶切后连接至质粒载体pET-28b上，限制性内切酶D基因的插入部位处于T7启动子后，经测序获得限制性内切酶D的重组质粒pET-D，将pET-D转化至ER2566-M.SssI感受态细胞后，涂布于含氯霉素及卡那霉素的LB平板上筛选克隆，获得限制性内切酶D的重组表达菌株ER2566-M.SssI-D；（2）限制性内切酶D的诱导表达将ER2566-M.SssI-D涂布于含氯霉素及卡那霉素的LB平板上，培养并挑取单菌落接种于含氯霉素及卡那霉素的LB培养液中，摇动培养一段时间，加入IPTG诱导表达限制性内切酶D；（3）限制性内切酶D的纯化（a）取经IPTG诱导后的ER2566-M.SssI-D菌培养液，离心收集菌体；（b）菌体以Ni柱结合缓冲液重悬后破碎处理，离心取上清粗蛋白溶液过Ni亲和层析纯化柱，分步收集，将纯度和浓度较高的收集样混合、透析；（c）取步骤（b）中透析后的收集样过阴离子交换层析柱，梯度洗脱，分步收集，将纯度和浓度较高的收集样混合、透析、贮存。本专利技术所述的利用甲基化酶的保护高效重组表达限制性内切酶的方法中，进一步优选的技术方案或者技术特征是：1、在步骤（一）中，设计引物时，根据NCBI数据库上螺原体属菌株MQ1（Spiroplasmasp.strainMQ1）的M.SssI基因序列设计一对引物，在上游引物5’端引入大肠杆菌组成型表达启动子E.colipltlpromoter序列，在下游引物5’端引入大肠杆菌终止子E.colirrnBT1terminator的反向互补序列，在上、下游引物的5’端还分别引入HindIII酶切识别序列和保护碱基。2、在步骤（一）中，所述的氯霉素的浓度为17.5-70μg/mL。3、在步骤（二）中，构建限制性内切酶D重组表达菌株时，所述的氯霉素和卡那霉素的浓度分别为17.5-70μg/mL、37.5-150μg/mL。4、在步骤（二）中，诱导表达限制性内切酶D时，将ER2566-M.SssI-D接种于含17.5-70μg/mL氯霉素和37.5-150μg/mL卡那霉素的LB培养基中培养并挑取单菌落，再按2-5%的接种量接种于含17.5-70μg/mL氯霉素和37.5-150μg/mL卡那霉素的LB培养液中，于37℃摇动培养，至菌密度达到3×108-4×108/mL时，加入IPTG至终浓度为0.2-0.5mM，并在15-18℃以200-250rpm摇动培养12-18h，诱导表达限制性内切酶D。5、在步骤（二）中，纯化限制性内切酶D时：（a）取经IPTG诱导后的ER2566-M.SssI-D培养液，以8000g离心10min收集菌体；（b）菌体由Ni柱结合缓冲液重悬后用细胞高压破碎仪破碎处理，43000g低温离心30min弃去沉淀，得到上清粗蛋白溶液，上清粗蛋白溶液过Ni亲和层析纯化柱，分步收集，将纯度和浓度较高的收集样混合、透析；所述的Ni柱结合缓冲液的组成如下：10mMTris-HClpH7.4，250mMNaCl，5%甘油，0.15%TritonX-100，5mM咪唑；其中，在Ni亲和层析过程中使用的缓冲液及其组成分别为：平衡缓冲液：10mMTris-HClpH7.4，250mMNaCl，5%甘油，0.15%TritonX-100，5m本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用甲基化酶的保护高效重组表达限制性内切酶的方法，其特征在于：所述的甲基化酶是M.Sss I；所述限制性内切酶D选自：AatII、AciI、AclI、AfeI、AgeI、AscI、AsiSI、AvaI、BceAI、BmgBI、BsaAI、BsaHI、BsiEI、BsiWI、BsmBI、BspDI、BspEI、BsrFI、BssHII、BstBI、BstUI、BtgZI、ClaI、EagI、FauI、FseI、FspI、HaeII、HgaI、HhaI、HinP1I、HpaII、Hpy99I、HpyCH4IV、KasI、MluI、NaeI、NarI、NgoMIV、NotI、NruI、Nt.BsmAI、Nt.CviPII、PaeR7I、PluTI、PmlI、PvuI、RsrII、SacII、SalI、SfoI、SgrAI、SmaI、SnaBI、TliI、TspMI、XhoI、XmaI、ZraI。

【技术特征摘要】
1.一种利用甲基化酶的保护高效重组表达限制性内切酶的方法，其特征在于：所述的甲基化酶是M.SssI；所述限制性内切酶D选自：AatII、AciI、AclI、AfeI、AgeI、AscI、AsiSI、AvaI、BceAI、BmgBI、BsaAI、BsaHI、BsiEI、BsiWI、BsmBI、BspDI、BspEI、BsrFI、BssHII、BstBI、BstUI、BtgZI、ClaI、EagI、FauI、FseI、FspI、HaeII、HgaI、HhaI、HinP1I、HpaII、Hpy99I、HpyCH4IV、KasI、MluI、NaeI、NarI、NgoMIV、NotI、NruI、Nt.BsmAI、Nt.CviPII、PaeR7I、PluTI、PmlI、PvuI、RsrII、SacII、SalI、SfoI、SgrAI、SmaI、SnaBI、TliI、TspMI、XhoI、XmaI、ZraI。2.根据权利要求1所述的利用甲基化酶的保护高效重组表达限制性内切酶的方法，其特征在于，包括：步骤（一）：将M.SssI基因克隆至质粒载体pACYC184上，得到M.SssI组成型质粒，转化宿主菌，筛选获得被甲基化保护的阳性重组菌株；步骤（二）：将所述限制性内切酶D的基因克隆至质粒载体pET-28b上，得到限制性内切酶D重组质粒，转化步骤（一）得到的已被甲基化保护的阳性重组菌，筛选稳定、可诱导、高表达的限制性内切酶D的重组表达菌株。3.根据权利要求2所述的利用甲基化酶的保护高效重组表达限制性内切酶的方法，其特征在于：所述的宿主菌为大肠杆菌。4.根据权利要求2所述的利用甲基化酶的保护高效重组表达限制性内切酶的方法，其特征在于：所述的步骤（一）包括：设计引物，根据设计的引物PCR扩增M.SssI基因，M.SssI的PCR产物经纯化、酶切后连接至质粒载体pACYC184上，连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经细胞培养后提取质粒，经测序获得M.SssI的组成型质粒pACYC184-M.SssI，将pACYC184-M.SssI转化大肠杆菌ER2566感受态细胞后，涂布于含氯霉素的LB平板上筛选克隆，获得M.SssI组成型表达菌株ER2566-M.SssI；所述的步骤（二）包括：（1）限制性内切酶D重组表达菌株的构建设计引物，根据设计的引物PCR扩增限制性内切酶D基因，限制性内切酶D的PCR产物经纯化、酶切后连接至质粒载体pET-28b上，限制性内切酶D基因的插入部位处于T7启动子后，经测序获得限制性内切酶D的重组质粒pET-D，将pET-D转化至ER2566-M.SssI感受态细胞后，涂布于含氯霉素及卡那霉素的LB平板上筛选克隆，获得限制性内切酶D的重组表达菌株ER2566-M.SssI-D；（2）限制性内切酶D的诱导表达将ER2566-M.SssI-D涂布于含氯霉素及卡那霉素的LB平板上，培养并挑取单菌落接种于含氯霉素及卡那霉素的LB培养液中，摇动培养一段时间，加入IPTG诱导表达限制性内切酶D；（3）限制性内切酶D的纯化（a）取经IPTG诱导后的ER2566-M.SssI-D菌培养液，离心收集菌体；（b）菌体以Ni柱结合缓冲液重悬后破碎处理，离心取上清粗蛋白溶液过Ni亲和层析纯化柱，分步收集，将纯度和浓度较高的收集样混合、透析；（c）取步骤（b）中透析后的收集样过阴离子交换层析柱，梯度洗脱，分步收集，将纯度和浓度较高的收集样混合、透析、贮存。5.根据权利要求4所述的利用甲基化酶的保护高效重组表达限制性内切酶的方法，其特征在于：在步骤（一）中，设计引物时，根据NCBI数据库上螺原体属菌株MQ1的M.Ss...

【专利技术属性】
技术研发人员：高嵩，尹欣，王佩，陈凯，韩挺翰，孙峰，许恒皓，
申请(专利权)人：淮海工学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32