本发明专利技术涉及一种过表达结核分枝杆菌Rv3586的重组卡介苗菌株及其应用。将含结核分枝杆菌Rv3586编码基因的质粒转化入卡介苗，筛选获得菌株称为Bacillus calmette‑Guerin rBCG‑DisA，简称为rBCG‑DisA，保藏编号为：CCTCC M 2016335。过表达Rv3586的重组卡介苗rBCG‑DisA兼具靶抗原和卡介苗的双重优势，单独免疫或联合结核分枝杆菌Ag85B‑ESAT6亚单位疫苗加强免疫，可诱导正常和感染小鼠更强的免疫应答，提高机体抗分枝杆菌的保护力，因而具有良好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于结核病疫苗领域。本专利技术涉及一种过表达结核分枝杆菌Rv3586的重组卡介苗菌株。本专利技术还涉及上述重组卡介苗菌株单独或联合亚单位疫苗Ag85B-ESAT6(AE)在结核病预防和治疗性疫苗及制剂中的应用。
技术介绍
结核病流行现状结核病(Tuberculosis，TB)仍然是全球范围内危害最严重的传染病。结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)是TB的病原体，全世界已有约1/3人口感染Mtb。据2014年WHO报告，全球约有960万新发TB病例。我国属于全球22个TB高负担国家之一，2014年我国新发TB人数为93万，次于印度和印度尼西亚而位居全球第三位。TB发病率仅次于病毒性肝炎，因此，TB被我国卫生部列为全国重点控制的重大疾病之一。结核病疫苗研究现状卡介苗(BacillusCalmette-Guérinvaccine，BCG)是目前用于结核病预防的唯一疫苗，但其存在着保护期短、保护性免疫应答不强等缺点，并且作为一种减毒活疫苗，不能用于免疫低下人群的接种。近年来关于新型TB疫苗的研究很多，包括一系列候选疫苗的筛选和不同的疫苗免疫策略。候选疫苗研究策略可分为两类：1)rBCG疫苗：构建重组rBCG以提高现有BCG疫苗菌株的效率；2)以亚单位疫苗、DNA疫苗、重组病毒减毒、Mtb营养缺陷疫苗、非Mtb分枝杆菌疫苗等代替原有BCG疫苗。BCG生物学特性和诱导机体的免疫应答反应与Mtb最相近，作为TB唯一预防疫苗，全球超过30亿人接种，证明其为安全的疫苗载体(KaufmannSH.Tuberculosisvaccinedevelopmentatadivide.CurrOpinPulmMed.2014May；20(3):294-300.)。国内外包括第四军医大学微生物学教研室研究，以BCG为载体成功表达了包括MtbAg85B和ESAT-6等一系列抗原，且其免疫学特性研究表明，可引起更强的免疫应答反应(Lu,Y.,etal.,NovelrecombinantBCGcoexpressingAg85B,ESAT-6andRv2608elicitssignificantlyenhancedcellularimmuneandantibodyresponsesinC57BL/6mice.ScandJImmunol,2012.76(3):p.271-7.)。BCG作为活疫苗载体具有以下优点：(1)BCG本身为一种强免疫佐剂，可提高宿主的免疫力。(2)BCG可在体内复制繁殖，可不断表达外源抗原，仅单次接种，即可获得持续的免疫应答；(3)所表达的保护性抗原直接用于免疫，保持其活性的同时免去蛋白纯化加工等步骤；(4)通过基因工程技术可根据需要对靶抗原进行修饰。表达Ag85B的重组BCG已被批准进入临床试验。AERAS、SSI、Sanofi和Intercell联合研制的Ag85B和TB10.4融合蛋白疫苗，目前正在进行I期临床试验。第四军医大学师长宏等前期研究表明，Ag85B-ESAT6(AE)融合抗原的表达增强了BCG的免疫原性，具有较强的疫苗潜能(ShiC，etal.Immuneresponsesandprotectiveefficacyinducedby85Bantigenandearlysecretedantigenictarget-6kDaantigenfusionproteinsecretedbyrecombinantbacilleCalmette-Guérin.ActaBiochimBiophysSin.2007；39(4):290～296.)。表明rBCG具有提高免疫原性，增强疫苗免疫效果的优势，因而具有较好的应用前景。对于Mtb保护性抗原的研究已持续多年，主要集中于分泌蛋白如ESAT-6、CFP10、Ag85、TB10.4、MTB39和MTB32等，热休克家族如Hsp65、Hsp70、HspX等，及融合蛋白MTB72f等抗原。但是，目前仍未获得替代传统BCG的rBCG，表明仍需充分利用现有研究成果，广泛筛选新的作用机制抗原，或改进疫苗构建方式或免疫策略，已获得更有效的rBCG及其免疫方式。结核分枝杆菌c-di-AMP合成酶Rv3586研究进展环二腺苷(Cyclicdi-adenosinemonophosphate，c-di-AMP)是2008年新发现的细菌小分子信号分子(Witte,G.,etal.,StructuralbiochemistryofabacterialcheckpointproteinrevealsdiadenylatecyclaseactivityregulatedbyDNArecombinationintermediates.MolCell,2008.30(2):p.167-78.)。c-di-AMP参与细菌芽胞形成、细胞壁形成、细胞壁压力感应及控制细菌大小等多种生理过程。体外实验证实，c-di-AMP可诱导宿主细胞固有免疫应答；而且c-di-AMP单独或联合抗原免疫，可调节Th1/Th2/Th17适应性免疫应答，具有显著的免疫佐剂作用(Ebensen,T,etal.,Bis-(3',5')-cyclicdimericadenosinemonophosphate:strongTh1/Th2/Th17promotingmucosaladjuvant.Vaccine,2011.29(32):5210-20.)。仅在细菌中发现c-di-AMP，而真核细胞中没有，因此c-di-AMP成为细菌疫苗和药物研究的新靶点。c-di-AMP由两分子ATP经二腺苷酸环化酶(DiadenylatecyclaseA，DacA)催化合成而来，枯草杆菌中的DisA是第一个发现的c-di-AMP合成酶。从金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌等致病菌中均发现了c-di-AMP合成酶DAC。第四军医大学柏银兰等前期研究中首次报道，Rv3586是Mtb中合成c-di-AMP的DAC酶，其结构和功能与DisA相似(Bai,Y.,etal.,MycobacteriumtuberculosisRv3586(DacA)isadiadenylatecyclasethatconvertsATPorADPintoc-di-AMP.PLoSOne,2012.7(4):p.e35206)。通过对Mtb基因组分析，发现Rv3586是Mtb中唯一的c-di-AMP合成酶。在Mtb中过表达Rv3586可调控细菌c-di-AMP水平，进行影响细菌毒性和宿主免疫应答。随后Yang和Bai等又研究发现，c-di-AMP水平升高菌株感染Mφ后，引起IFN-β为特征的固有免疫激活，并可降低细菌的毒力(Yang,J.,Y.Bai,Y.Zhang,V.D.Gabrielle,L.Jin,andG.Bai.Deletionofthecyclicdi-AMPphosphodiesterasegene(cnpB)inMycobacteriumtuberculosisleadstoreducedvirulenceinamousemodelofinfection.MolMicrobiol,2014.93(1):65本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种过表达结核分枝杆菌Rv3586的重组卡介苗菌株，将包含结核分枝杆菌Rv3586蛋白编码基因的重组质粒转化入卡介苗，筛选获得的阳性菌株简称为rBCG‑DisA，其保藏编号为：CCTCC M2016335。
【技术特征摘要】
1.一种过表达结核分枝杆菌Rv3586的重组卡介苗菌株，将包含结核分枝杆菌Rv3586蛋白编码基因的重组质粒转化入卡介苗，筛选获得的阳性菌株简称为rBCG-DisA，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：柏银兰，徐志凯，王立飞，康健，路延之，宁唤唤，吴俊杰，宋世杰，姚庆港，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61
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