本发明专利技术涉及一种利用枯草芽孢杆菌高效表达磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI‑PLC)基因的方法，所述方法包括：将SEQ ID No：1所示序列与pBE980a质粒连接，构建得到重组表达载体转化至大肠杆菌EPI400中，筛选阳性克隆转化至枯草芽孢杆菌中，获得重组基因工程菌进行诱导培养，于培养液中获得转化后的磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C。本发明专利技术构建了磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI‑PLC)的枯草芽孢杆菌表达系统，成功实现了PI‑PLC基因在枯草芽孢杆菌中的异源高表达，为后续PI‑PLC的批量生产奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
(一)
本专利技术涉及利用枯草芽孢杆菌高效表达磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)基因的方法。(二)
技术介绍
磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)的种类很多，在细菌、原生动物、酵母、霉菌、植物、昆虫和哺乳动物中均存在。在各个领域均有应用：医药领域，主要作为疫苗用于预防各种病原菌的感染；食品领域，多用于面包烘培、奶制品加工、保健食品等；工业领域，主要用于油脂精炼、磷脂改性、动物饲料添加剂等。鸡球虫病发病率高(50～70％)，致死率高(50～80％)，严重危害养殖业，每年因球虫病造成的损失高达数十亿美元。现有鸡球虫病防治，主要依靠化学药物，但存在耐药性、药物残留等不足，若采用接种疫苗方式进行防治，又存在风险较大、且研发困难的不足，而采用抗生素或中草药，也存在耐药性的问题，且效果一般。因此，亟需寻找一种新的抗球虫药物替代化学药物来有效控制鸡球虫病。细菌PI-PLC可裂解细胞膜表面糖基锚定蛋白，从而影响细胞膜表面上糖蛋白及碳水化合物的释放，而球虫等大多数致病性寄生虫细胞膜表面抗原都是通过糖基锚定在细胞上的，PI-PLC能切断锚定蛋白中肌醇磷脂与细胞膜的连接，使寄生虫丧失入侵宿主细胞和在宿主细胞内增殖的能力，因此PI-PLC显示出显著的抗球虫感染特性。PI-PLC的抗球虫机理为新型抗球虫药的开发提供了理论基础。PI-PLC降低了球虫因耐药性加剧而爆发的风险，避免养殖业因球虫病复发而造成的重大损失。PI-PLC广泛分布于动植物以及微生物的体内，本身就参与机体细胞的代谢和信息交流，不存在产生耐药性及药物残留等问题。具有安全、无毒害作用。通过微生物异源表达，可以大量生产PI-PLC，降低抗球虫药的使用成本。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供利用枯草芽孢杆菌高效表达磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)基因的方法。本专利技术采用的技术方案是：一种利用枯草芽孢杆菌高效表达磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)基因的方法，所述方法包括：将SEQIDNo：1所示序列与pBE980a质粒连接，构建得到重组表达载体转化至大肠杆菌EPI400中，筛选阳性克隆转化至枯草芽孢杆菌中，获得重组基因工程菌进行诱导培养，于培养液中获得转化后的磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C。SEQIDNo：1序列如下：5’-gcgtcaagcgtgaacgaactggaaaattggagcaaatggatgcaaccgattcctgattcaatcccgcttgcgcgtattagcatccctggcacgcatgactctggaacatttaaattgcaaaacccgatcaaacaggtttggggcatgacacaagaatacgattttcgttatcagatggaccatggtgctcggatttttgatatcagaggccgcttaacggatgacaatacaatcgttttgcatcatggaccgttgtacttgtacgtgacgttgcatgaatttatcaacgaagcgaaacagtttttgaaagataacccttcagaaacaatcatcatgagcttgaaaaaagaatacgaagatatgaaaggcgctgaagactctttttcttccacgtttgagaaaaaatactttgtcgatcctatctttctgaaaacagaaggaaacatcaaacttggagacgccagaggtaaaattgtactgcttaaacgctattctggttccaacgaaccgggcggatacaacaacttttactggcctgataacgaaacgtttacaacgacagtgaatcaaaacgcaaatgttacagtgcaggataaatacaaagtctcctacgacgaaaaagtaaaaagcatcaaagatacgatggacgaaacaatgaataactctgaagatctgaaccatctttacatcaactttacgtcactttcaagcggtggcacagcttggaattctccgtattactatgcctcctacatcaaccctgaaatcgcaaactacatcaaacagaaaaatccggcacgcgtcggatgggtaatccaggattatattaatgaaaaatggagcccgttactgtatcaagaagtcatcagagcaaataaatccttaatcaaagaataa-3’。最终表达的序列如下：gcgtcaagcgtgaacgaactggaaaattggagcaaatggatgcaaccgattcctgattcaatcccgcttgcgcgtattagcatccctggcacgcatgactctggaacatttaaattgcaaaacccgatcaaacaggtttggggcatgacacaagaatacgattttcgttatcagatggaccatggtgctcggatttttgatatcagaggccgcttaacggatgacaatacaatcgttttgcatcatggaccgttgtacttgtacgtgacgttgcatgaatttatcaacgaagcgaaacagtttttgaaagataacccttcagaaacaatcatcatgagcttgaaaaaagaatacgaagatatgaaaggcgctgaagactctttttcttccacgtttgagaaaaaatactttgtcgatcctatctttctgaaaacagaaggaaacatcaaacttggagacgccagaggtaaaattgtactgcttaaacgctattctggttccaacgaaccgggcggatacaacaacttttactggcctgataacgaaacgtttacaacgacagtgaatcaaaacgcaaatgttacagtgcaggataaatacaaagtctcctacgacgaaaaagtaaaaagcatcaaagatacgatggacgaaacaatgaataactctgaagatctgaaccatctttacatcaactttacgtcactttcaagcggtggcacagcttggaattctccgtattactatgcctcctacatcaaccctgaaatcgcaaactacatcaaacagaaaaatccggcacgcgtcggatgggtaatccaggattatattaatgaaaaatggagcccgttactgtatcaagaagtcatcagagcaaataaatccttaatcaaagaataa其编码的氨基酸序列为：assvnelenwskwmqpipdsiplarisipgthdsgtfklqnpikqvwgmtqeydfryqmdhgarifdirgrltddntivlhhgplylyvtlhefineakqflkdnpsetiimslkkeyedmkgaedsfsstfekkyfvdpiflktegniklgdargkivllkrysgsnepggynnfywpdnetftttvnqnanvtvqdkykvsydekvksikdtmdetmnnsedlnhlyin本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用枯草芽孢杆菌高效表达磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI‑PLC)基因的方法，所述方法包括：将SEQ ID No：1所示序列与pBE980a质粒连接，构建得到重组表达载体转化至大肠杆菌EPI400中，筛选阳性克隆转化至枯草芽孢杆菌中，获得重组基因工程菌进行诱导培养，于培养液中获得转化后的磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C。
【技术特征摘要】
1.一种利用枯草芽孢杆菌高效表达磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)基因的方法，所述方法包括：将SEQIDNo：1所示序列与pBE980a质粒连接，构建得到重组表达载体转化至大肠杆菌EPI400中，筛选阳性克隆转化至枯草芽孢杆菌中，获得重组基因工程菌进行诱导培养，于培养液中获得转化后的磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下：(1)表达载体构建：以SEQIDNo：2所示PI-PLC基因为模板，以P1/P2为引物进行PCR扩增：引物P1：5’-GCCAAGCTTGCGTCAAGCGTGAACGAACTGGAAAATTGG-3’；引物P2：5’-GCCG...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘伟，皮雄娥，王欣，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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