一种具有降血糖活性和透皮能力的重组融合蛋白、编码基因及其应用制造技术

一种具有降血糖活性和透皮能力的重组融合蛋白TAT‑Exendin‑4及其编码基因与应用。本发明专利技术提供了一种融合蛋白，是在艾塞那肽的N末端连接linker和TAT穿膜肽。为如下(1)(2)(3)所示：(1)SEQ ID No.5所示蛋白；(2)SEQ ID No.5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的氨基酸序列；(3)SEQ ID No.5所示蛋白，其特征在于，所示融合蛋白是通过linker将艾塞那肽和TAT穿膜肽连接。本发明专利技术公开的重组融合蛋白，能在有效降低血糖的基础上，提高艾塞那肽透皮吸收能力，对改变艾塞那肽给药途径具有重大价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种具有透皮吸收作用和降血糖作用的融合蛋白及其编码基因与应用，属于生物

技术介绍
糖尿病是一类以高血糖为特征的代谢性疾病，多发于40岁以上的中老年人群。世界卫生组织数据显示全世界目前现有3.47亿糖尿病患者，预测到2030年，糖尿病将成为全球第七大死亡原因。我国是全球糖尿病第一大国，目前有超过9200万的糖尿病患，另外还有1亿5000人将成为患者。无论是糖尿病的传统治疗药物胰岛素，还是新型药物如艾塞那肽都需要每天两到三次注射给药，患者顺应性差。改变肽类降糖药物给药方式，提高患者顺应性，成为目前糖尿病治疗领域的研究热点，具有广阔的市场前景。透皮给药系统，即经皮治疗系统，是药物通过皮肤吸收的一种给药方法，是近年来国内外药剂学研究的热点。经皮给药是一种理想的给药方式，具有许多显著的优势。有学者利用离子导入、超声技术等方法对胰岛素透皮吸收进行了研究，在一定程度上促进了蛋白质透皮吸收的研究。但是物理方法促渗一般需要较大的配套仪器，而目前用于小分子促渗的化学促渗剂又具有一定细胞毒性，限制这两种方法在上的临床上的使用。细胞穿膜肽具有安全，有效且简单易行等优点，成为了近些年来透皮给药系统的研究热点。艾塞那肽(Exendin-4)又称促胰岛素分泌肽，是从生长在美国两部和墨西哥沙漠的希拉毒蜥唾液中发现的一种胰高血糖素素样肽(GLP-1)类似物，由39个氨基酸组成，与GLP-1有53％的同源性，属于小分子多肽类激素。其作用方式与GLP-1类似，在进食后可以促进胰岛素分泌及激活胰岛素前体基因转录，具有稳定性好、半衰期长的优点，在糖尿病等治疗方面具有广阔的前景。Exendin-4于2005经美国FDA批准上市，2009年在中国获批上市。丰富的临床使用经验证实Exendin-4能达到与胰岛素治疗相似的血糖控制效果；而且与甘精胰岛素和双时相门冬胰岛素相比，艾塞那肽能更严格地控制餐后血糖，低血糖反应少且有减轻体重的优势。人类免疫缺陷病毒HIV-I的转录活化因子TAT(HIVtrans-activatoroftranscription)是目前研究最成熟的细胞穿膜肽，1988年美国两个独立的课题研究组同时报道了这种多肽，其独特的细胞穿膜能力引起起了科学界对于TAT功能研究的热潮。至今为止TAT穿膜肽已经被用于多种蛋白、脂质体、纳米颗粒传递、基因治疗、反义寡核苷酸等多个领域的研究。作为细胞穿膜肽的典型代表，TAT穿膜肽提供了一种无毒且高效的通过皮肤屏障的方法，对于大分子药物透皮给药系统具有一定的实际应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种具有透皮吸收作用和降血糖作用的融合蛋白及其编码基因与应用。一种融合蛋白，为如下(1)(2)(3)所示：(1)SEQIDNo.5所示蛋白；(2)SEQIDNo.5所示蛋白的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的氨基酸序列；(3)SEQIDNo.5所示蛋白，其特征在于，所示融合蛋白是通过linker将艾塞那肽和TAT穿膜肽连接。上述蛋白的编码基因也属于本专利技术保护范围上述编码基因中，所述编码基因应为如下至少一种：(1)SEQIDNo.4所示的DNA序列；(2)与(1)限定的DNA序列具有90％以上同一性且编码权利1所述蛋白的DNA序列。(3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA序列分子杂交且编码权利要求书1所述蛋白质的DNA序列。含上述任一所述编码基因的的重组表达载体、转基因细胞系、表达盒或重组菌也在保护范围内。本蛋白除了通过基因工程方法(上述)来获得之外，也可以通过芴甲氧羰基法和叔丁氧羰基法等化学法合成，或通过肽合成仪进行合成。一种制备上述蛋白的方法也在保护范围内，该方法是将所述的编码基因导入原核细胞进行表达。在上述方法中，所述编码基因是通过重组表达载体导入的，所述的重组表达载体是将权利要求2或3所述的编码基因插入pET22b(+)的多克隆位点得到的，具体是将权利要求2或3所述的编码基因插入pET22b(+)的NdeI和HindIII位点间得到的。所述原核细胞为大肠杆菌，具体为大肠杆菌BL21(DE3)。上述所述任一方法中，所述表达之后还包括将细胞破碎、离心取上清和、将上清进行分离纯化的步骤。上述所述方法中，所述的细胞破碎为超声破碎。所述的上清分离纯化依次进行盐析、除盐、阳离子交换层析、凝胶层析。上述融合蛋白或上述任一编码基因编码的蛋白通过皮肤涂抹给药在降低血糖方面的应用。上述融合蛋白或上述任一编码基因编码的蛋白通过皮肤涂抹给药在改善II型糖尿病患者的血糖控制中的应用。上述融合蛋白或上述任一编码基因编码的蛋白通过皮肤涂抹给药在用于单用二甲双胍、磺酰脲类.以及二甲双胍合用磺酰脲类，血糖仍控制不佳的患者的治疗方面的应用。上述融合蛋白或上述任一编码基因编码的蛋白通过皮肤涂抹给药在超重II型糖尿病患者接受胰岛素治疗前的应用。附图说明图1：TAT-艾塞那肽融合蛋白基因琼脂糖凝胶电泳图。泳道M：DNAmarker，泳道1：回收168bpTAT-艾塞那肽融合蛋白基因图2：TAT-艾塞那肽融合蛋白表达及纯化后SDS-PAGE电泳图泳道M：蛋白marker，泳道1：TAT-艾塞那肽融合蛋白在大肠杆菌中表达电泳图，泳道2：TAT-艾塞那肽融合蛋白最终纯化结果图3：不同浓度TAT-艾塞那肽融合蛋白刺激MIN6细胞分泌胰岛素结果：随着TAT-艾塞那肽融合蛋白浓度的提高，MIN6细胞分泌胰岛素的量逐渐增加，且成明显的剂量相关性。证明TAT-艾塞那肽融合蛋白具有和艾塞那肽相同的生物活性，能有效增加MIN6细胞胰岛素分泌量。图4：TAT-艾塞那肽融合蛋白对大鼠血糖的调节作用结果实验组，■对照组，▲与对照组相比，TAT-Exendin-4融合蛋白在皮肤涂抹给药后可以达到一定的降血糖疗效。后续还需对涂抹剂量进行摸索，使得获得更加的治疗效果。具体实施方式下述实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料，试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实例中的定量实验，均设置三次重复，结果取平均值。实施例1重组融合蛋白pET22b-TAT-Exendin-4载体的构建。委托南京金斯瑞生物科技有限公司通过化学合成法合成含有TAT-Exendin-4的目的基因，并插入到PET22b质粒中。实例2重组融合蛋白TAT-Exendin-4在大肠杆菌BL21中重组表达。使用《分子克隆》(卢圣栋编)中所述的标准方法将连接混合物转入大肠杆菌宿主菌BL21。在含有AMP的抗性的LB平板上进行转化，经过12-16小时的生长，挑取单克隆转化菌落，在含有AMP抗性的LB液体培养基中过夜培养，进行菌落PCR初步筛选出阳性克隆，经测序确定含有TAT-Exendin-4的阳性重组质粒中的TAT-Exendin-4融合蛋白序列与理论完全一致。将上述测序正确的BL21表达重组菌，按照1％的甘油管接种量接入含有终浓度为100μg/mlAMP抗性的LB培养基中，在37℃，220rpm摇床中培养至OD600约为1.7时，加入终浓度为0.2μM的IPTG进行TAT-Exendin-4的诱导表达，诱导6h后收集菌体，离心得到湿菌体，并以SDS-PAGE检测。将上述获得的发酵液在80本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种融合蛋白，为如下(1)(2)(3)所示：(1)SEQ ID No.5所示蛋白；(2)SEQ ID No.5示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的氨基酸序列；(3)SEQ ID No.5所示蛋白，其特征在于，所示融合蛋白是通过linker将艾塞那肽和TAT穿膜肽连接，所述Linker序列如SEQ ID No.3所示。

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，为如下(1)(2)(3)所示：(1)SEQIDNo.5所示蛋白；(2)SEQIDNo.5示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的氨基酸序列；(3)SEQIDNo.5所示蛋白，其特征在于，所示融合蛋白是通过linker将艾塞那肽和TAT穿膜肽连接，所述Linker序列如SEQIDNo.3所示。2.权利1所述蛋白的编码基因。3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下中的至少一种：(1)SEQIDNo.5所示的DNA序列；(2)与(1)限定的DNA序列具有90％以上同一性且编码权利1所述蛋白的DNA序列；(3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA序列分子杂交且编码权利要求书1所述蛋白质的DNA分子。4.含有权利2或3所述融合蛋白的编码基因的重组表达载体、转基因细胞系、表达盒或重组菌。5.含权利2或3所述蛋白通过芴甲氧羰基法和叔丁氧羰基法等化学法合成，或通过肽合成仪进行合成。6.一种制备权利要求1所述蛋白的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈建华，罗薇，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32