一种皮肤来源的成纤维细胞的培养方法技术

本发明专利技术涉及细胞分离培养技术领域，特别涉及成纤维细胞的分离培养方法。本发明专利技术提供一种皮肤来源的成纤维细胞的分离培养方法，包括如下步骤：1)采用两步酶消化法从人皮肤组织获得成纤维细胞；2)用DMEM和F12培养基并添加细胞生长因子EGF和/或bFGF培养成纤维细胞，DMEM培养基与F12培养基的比例为1:1。用DMEM/F12(1:1)培养基可有效促进成纤维细胞的增殖，保持成纤维细胞原有细胞形态，提高细胞前期胶原蛋白表达，EGF和bFGF能促进了成纤维细胞的增殖和胶原蛋白分泌的增加。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞分离培养
，特别涉及成纤维细胞的分离培养方法。
技术介绍
医疗技术的发展及人们生活水平的提高，使人类平均寿命得到有效延长的同时，也使延缓衰老渐渐进入人类视野。而皮肤作为人体最大的器官，其结构完整、美观不仅影响着心情，也体现其生活质量的高低。因此，越来越多的爱美人士渴望通过医疗技术干预皮肤老化。然而，目前市场主流的抗衰老产品多以化学药物或激光疗法为主，其短期效果明显，但长期效果及安全性却一直备受质疑。自体细胞回输技术，其采用体外培养自体成纤维细胞达一定数目及活性后，将其回输入人体执行特定皮肤部位老化细胞的功能，从而对延缓皮肤衰老起到促进作用，具有更高的安全性及有效性。然而，如何快速获得活性细胞在一定程度上制约了自体细胞回输技术的临床应用。衰老是人类生命历程中不可缺少的环节，且往往从一个细胞群的老化为起点。而成纤维细胞作为是皮肤中重要的细胞之一，其不仅能合成及分泌胶原蛋白来维持皮肤弹性及韧性，同时也可在皮肤受到损伤时，参与组织修复。而目前研究证实，成纤维细胞活性减弱，胶原蛋白分泌量减少是皱纹产生的重要因素。目前抗皱化妆品种多含有人表皮神经生长因子，碱性成纤维细胞生长因子等，这类生长因子也主要作用于成纤维细胞。此外，针对皮肤性疾病或烧伤等意外引起的皮肤缺损，单靠自体皮肤移植已不能满足临床应用需求，若能在短时间内，通过体外培育出大量的人表皮成纤维细胞或将为临床应用提供新的思路。由此可见，表皮成纤维细胞的培养具有极高的临床应用价值。生长因子(Growthfactor)存在于体内并对机体细胞的生长发育具有调节作用的一类细胞因子，在体内含量极微，但是生物活性极高。然而随着年龄的增长，皮肤生长因子自身分泌不断下降，作用减弱，因此外源生长因子的导入来赋予细胞新的活力成为了生物美容的新热点和突破口。其中人表皮细胞生长因子(humanepidermalgrowthfactor,EGF)能够启动与细胞分裂有关的基因，促使细胞进行有丝分裂，有效的促进和调节皮肤细胞的生长和增殖。碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)可刺激多种细胞进行有丝分裂、增殖和迁移，在皮肤和创面修复中有重要作用。此外EGF和bFGF具有多种生物活性，改善细胞生长的微环境，促进羟脯氨酸的合成，促使胶原和弹性纤维合成，分泌胶原物质、透明质酸和糖蛋白，从而使肌肤富有弹性，更加嫩滑有光泽，并减少皱纹的产生，延缓皮肤衰老。以往研究中多采用包皮组织作为实验用皮肤，虽其具有取材方便的优点，但皮肤来源均为男性，在实际应用中并不能广泛代表所有人群皮样特点。采用植块法，不仅操作步骤繁琐如及时翻转细胞培养瓶等，且细胞需培养14天以上才可顺利进行传代，且远离组织块处细胞已明显变大、老化，使得获得细胞质量及数量均不如酶消化法。而鉴于大多数人群的耳后皮肤在实际生活中均较少受到摩擦，皮肤细胞更替慢，其个体间差异较小，从而能更具有广泛性结果。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种成纤维细胞的培养方法，该方法用两步酶消化法从耳后皮肤中获得的成纤维细胞，采用DMEM和F12完全培养基并加入EGF、bFGF细胞生长因子，有助于成纤维细胞的增殖、胶原蛋白的分泌及延缓衰老。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：本专利技术提供了一种皮肤来源的成纤维细胞的分离培养方法，包括如下步骤：1)采用两步酶消化法从人皮肤组织获得成纤维细胞；2)用DMEM和F12培养基并添加细胞生长因子EGF和/或bFGF培养成纤维细胞，DMEM培养基与F12培养基的比例为1:1。优选地，步骤1)中的酶消化法采用0.25％胰蛋白酶和0.02MEDTA消化人皮肤组织，再加入1mg/mlII型胶原蛋白酶。更优选地，步骤1)为无菌条件下取人皮肤组织，去掉皮下组织及血管，按体积质量比5:1加入0.25％胰蛋白酶和0.02MEDTA，4℃过夜处理。第二日取出皮肤，去掉表皮，按体积质量比10:1加入1mg/mlII型胶原蛋白酶，37℃，2h处理，将上述混悬液过200目筛网，吹打滤过液，进行离心。优选地，步骤1)中的人皮肤组织为人耳后皮肤。优选地，步骤2)中的细胞生长因子的浓度为：EGF活力单位为75U/ml，bFGF活力单位为100U/ml。优选地，步骤2)中成纤维细胞在37℃、5％CO2培养24h。本专利技术还提供了一种成纤维细胞的分离培养方法，包括如下步骤：1)无菌条件下取人耳后皮肤，去掉皮下组织及血管，按体积质量比5:1加入0.25％胰蛋白酶和0.02MEDTA，4℃过夜处理。第二日取出皮肤，去掉表皮，按体积质量比10:1加入1mg/mlII型胶原蛋白酶，37℃，2h处理，将上述混悬液过200目筛网，吹打滤过液，进行离心；2)将上述成纤维细胞加入比例为1:1的DMEM培养基和F12培养基中，37℃、5％CO2培养24h，弃去培养液，并添加细胞生长因子活力单位为75U/ml的EGF和/或100U/ml的bFGF，继续37℃、5％CO2培养24h，获得培养的成纤维细胞。本专利技术对耳后皮肤中成纤维细胞进行提取，传代，研究不同培养基并在之中添加生长因子对成纤维细胞细胞增殖、胶原分泌以及细胞传代中的稳定性进行分析，本专利技术特以人耳后皮肤作为实验用组织。另外，本专利技术采用酶消化法替代植块法。对于0.5cm*0.5cm皮肤块，经酶消化后24小时即可见成纤维细胞贴壁，消化后72-96小时可见大量成纤维细胞贴壁，不仅保证细胞数目及细胞正常形态，同时减少细胞增殖次数，缩短实验周期。此外，针对酶消化法中的残留的表皮细胞，表皮细胞较成纤维细胞更加耐受胰酶，但贴壁速度慢，因此采用快速酶消化，早期替换培养液的方法可获得高纯度的成纤维细胞。采用两步酶消化法从健康人耳后皮肤中获得成纤维细胞，依据培养基种类不同分为A组(FM无血清培养基)、B组(DMEM+10％FBS)、C组(RPMI-1640+10％FBS)、D组(DMEM/F12(1:1)+10％FBS)，并将细胞生长因子(EGF、bFGF)加入到培养基中，采用MTT法、细胞划痕实验、酶联免疫吸附实验、β-半乳糖苷酶试验、软琼脂克隆形成试验比较不同培养基和细胞因子对细胞增殖、迁移、胶原分泌、老化、变异的影响。本专利技术的有益效果是：用DMEM/F12(1:1)培养基可有效促进成纤维细胞的增殖，保持成纤维细胞原有细胞形态，提高细胞前期胶原蛋白表达，EGF和bFGF能促进了成纤维细胞的增殖和胶原蛋白分泌的增加。附图说明图1表示细胞原代培养中，B、D组在培养72h后的示意图，B组为DMEM+10％FBS，D组为DMEM/F12(1:1)+10％FBS。图2表示细胞原代培养中，B、D组通过3次传代后的示意图，B组为DMEM+10％FBS，D组为DMEM/F12(1:1)+10％FBS。图3表示MTT实验，A、B、C、D组细胞增殖曲线，A组为FM无血清培养基，B组为DMEM+10％FBS，C组为RPMI-1640+10％FBS,D组为DMEM/F12(1:1)+10％FBS。图4细胞迁移实验，A组为FM无血清培养基，B组为DMEM+10％FBS，C组为RPMI-1640+10％FBS,D组为DMEM/F12(1:1)+本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种皮肤来源的成纤维细胞的分离培养方法，包括如下步骤：1)采用两步酶消化法从人皮肤组织获得成纤维细胞；2)用DMEM和F12培养基并添加细胞生长因子EGF和/或bFGF培养成纤维细胞，DMEM培养基与F12培养基的比例为1:1。

【技术特征摘要】
1.一种皮肤来源的成纤维细胞的分离培养方法，包括如下步骤：1)采用两步酶消化法从人皮肤组织获得成纤维细胞；2)用DMEM和F12培养基并添加细胞生长因子EGF和/或bFGF培养成纤维细胞，DMEM培养基与F12培养基的比例为1:1。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中的酶消化法采用0.25％胰蛋白酶和0.02MEDTA消化人皮肤组织，再加入1mg/mlII型胶原蛋白酶。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)为无菌条件下取人皮肤组织，去掉皮下组织及血管，按体积质量比5:1加入0.25％胰蛋白酶和0.02MEDTA，4℃过夜处理；第二日取出皮肤，去掉表皮，按体积质量比10:1加入1mg/mlII型胶原蛋白酶，37℃，2h处理，将上述混悬液过200目筛网，吹打滤过液，进行离心。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中的人皮肤组织为人耳后皮肤。5.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：林峰，
申请(专利权)人：深圳职业技术学院，
类型：发明
国别省市：广东;44